Identificación de tejido tumoral en muestras patológicas finas mediante láser de femtosegundo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9250 (2023) Citar este artículo

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En el tratamiento de la mayoría de los tumores cancerosos sólidos recién descubiertos, la cirugía sigue siendo la primera opción de tratamiento. Un factor importante en el éxito de estas operaciones es la identificación precisa de los márgenes de seguridad oncológica para garantizar la extirpación completa del tumor sin afectar gran parte del tejido sano vecino. Aquí informamos sobre la posibilidad de aplicar espectroscopía de descomposición inducida por láser de femtosegundo (LIBS) combinada con algoritmos de aprendizaje automático como técnica de discriminación alternativa para diferenciar el tejido canceroso. Los espectros de emisión después de la ablación en muestras postoperatorias delgadas de hígado y mama se registraron con alta resolución espacial; Las secciones teñidas adyacentes sirvieron como referencia para la identificación del tejido mediante análisis patológico clásico. En una prueba de prueba de principio realizada en tejido hepático, los algoritmos de redes neuronales artificiales y bosque aleatorio pudieron diferenciar tanto el tejido sano como el tumoral con una precisión de clasificación muy alta, de alrededor de 0,95. La capacidad de identificar tejido desconocido se realizó en muestras de mama de diferentes pacientes, proporcionando también un alto nivel de discriminación. Nuestros resultados muestran que LIBS con láseres de femtosegundo es una técnica con potencial para ser utilizada en aplicaciones clínicas para la identificación rápida del tipo de tejido en el campo quirúrgico intraoperatorio.

La cirugía sigue siendo la principal línea de ataque para erradicar el cáncer descubierto en sus primeras etapas. La mayoría de los tumores sólidos recién diagnosticados se extirpan mediante cirugía, con la esperanza de lograr una curación completa o al menos prolongar la esperanza de vida del paciente1. Las células cancerosas que quedan después de la operación (p. ej., por márgenes positivos de la muestra de resección) pueden generar recurrencias locales o metástasis con el tiempo, siendo uno de los factores clave que determinan la tasa de supervivencia de un paciente. En muchos casos, son necesarias intervenciones quirúrgicas posteriores para extirpar el tejido neoplásico recién formado, o terapias adyuvantes (radioterapia o quimioterapia), que tienen muchos efectos secundarios. Los resultados de la cirugía están determinados principalmente por la experiencia del equipo médico que realiza la intervención oncológica: el objetivo es eliminar completamente las células malignas (para evitar nuevas recurrencias) y preservar la mayor cantidad de tejido posible del órgano afectado, sin degradar su funcionalidad. En la práctica, los márgenes de seguridad oncológica varían entre 2 mm y 1 cm, dependiendo del tipo de cáncer y de la localización del tumor2. La localización de alta precisión del tumor es de crucial importancia para el éxito de la operación. El equipo quirúrgico puede utilizar la información obtenida antes de la operación a partir de técnicas de imagen (tomografía por resonancia magnética, tomografía computarizada por rayos X o ecografía), pero en el campo operatorio las decisiones se basan principalmente en información visual y táctil. Muchas veces, para decidir si el tejido maligno ha sido extirpado por completo, se recurre al examen patológico intraoperatorio sobre una muestra congelada. Este procedimiento requiere varias decenas de minutos y, en caso de incertidumbre, aumentaría significativamente el tiempo de la operación, aumentando el riesgo de complicaciones. Por este motivo, es muy deseable una técnica alternativa o complementaria con un establecimiento rápido y preciso del tipo de tejido intervenido.

En los últimos años se han investigado varias técnicas innovadoras para el análisis in vivo. Las técnicas de espectroscopía de masas, en las que se miden valores de masa/carga de diferentes fragmentos moleculares resultantes de la descomposición local del tejido, ya se han probado in vivo para identificar diferentes tipos de cáncer3,4,5. Paralelamente, se han investigado técnicas ópticas, como la tomografía de coherencia óptica6,7, la espectroscopia Raman8,9,10 y la espectroscopia de ruptura inducida por láser (LIBS), debido a su portabilidad y alta precisión espacial. Aunque los primeros intentos de utilizar LIBS para detectar tejido canceroso se remontan a casi dos décadas11, el desarrollo en los últimos años de algoritmos de aprendizaje automático (ML) para interpretar un gran volumen de datos experimentales ha intensificado estos estudios12. La técnica LIBS analiza los espectros de emisión del plasma creado por láseres enfocados a la superficie de los materiales. Tiene la ventaja de producir resultados rápidos en una amplia variedad de muestras que no requieren un tratamiento previo complicado. En el proceso LIBS se ioniza el material y se produce plasma, que al enfriarse emitirá radiación específica de los elementos químicos existentes en el material. Muchos estudios que intentan identificar diferentes tipos de tejido maligno se realizan utilizando láseres de nanosegundos12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, produciendo plasma a alta temperatura con importante daño térmico a la muestra y una disminución de la resolución espacial23. En estudios anteriores, hemos demostrado que los pulsos de femtosegundos (fs) se pueden utilizar para análisis LIBS de precisión in situ/in vivo de tejido biológico23 y muestras técnicas24, lo que permite una resolución espacial del orden de micras y por debajo de 25. Aplicaciones de fs-LIBS sobre diferentes tejidos biológicos se presentan en varios estudios (Ref.26 y referencias allí), pero su uso en la detección de tejido canceroso ha sido menos investigado12,27,28,29.

Este artículo presenta nuestros resultados en la identificación de cáncer de hígado y de mama en muestras patológicas humanas estándar utilizando algoritmos fs-LIBS y ML. Aprovechando las ventajas de los pulsos láser ultracortos, pudimos registrar espectros de emisión atómica y molecular tras la ablación en muestras muy finas con un espesor de unas pocas micras. El tipo de tejido a partir del cual se origina el espectro registrado (utilizado en el entrenamiento y evaluación de algoritmos de ML) podría identificarse mediante comparación directa con los resultados del análisis patológico en cortes adyacentes. Hasta donde sabemos, este tipo de análisis en muestras de espesor micrométrico se realizó sólo en un estudio reciente sobre tejido tumoral gastrointestinal mediante el uso de pulsos de láser ns22, pero los espectros presentados en esta publicación tienen una fuerte contribución espectral del sustrato, con muchas emisiones. líneas que se superponen con las que provienen del tejido biológico. Utilizando pulsos de láser ultracortos y un sustrato de cuarzo de alta pureza, realizamos la ablación con una alta resolución espacial y bajo daño colateral, y los espectros registrados contienen solo contribuciones de la muestra.

El artículo está estructurado de la siguiente manera: la siguiente sección presenta el procedimiento experimental y la información de preparación de la muestra. Luego, fs-LIBS y ML se prueban con tejido hepático para observar si los espectros obtenidos de muestras patológicas muy finas se pueden utilizar para identificar el tipo de tejido. Además, en este apartado se investiga la reproducibilidad de las mediciones mediante comparaciones entre los datos registrados en diferentes días. La última sección presenta los resultados obtenidos del cáncer de mama y cómo los algoritmos ya entrenados en algunos pacientes pueden usarse para detectar células cancerosas en un paciente diferente.

Un sistema láser amplificado de Ti: Zafiro (Femtolasers, Femtopower Pro) generó pulsos láser con un ancho temporal de 30 fs a una longitud de onda central de 785 nm y una tasa de repetición de 1 kHz. La tasa de repetición se reduce a un solo disparo utilizando la celda de Pockels (como selector de pulso electroóptico) dentro del amplificador. La luz polarizada linealmente se guió hasta un moldeador de pulsos de construcción casera de alta precisión30,31, donde la dispersión general de los elementos ópticos hasta la superficie de la muestra se compensó utilizando una señal de fotodiodo de dos fotones como retroalimentación. Entre el sistema láser y la plataforma del microscopio disponemos de varios componentes ópticos para variar y registrar la energía de los pulsos. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la configuración fs-LIBS utilizada en este estudio. Los componentes principales de la plataforma del microscopio son una cámara de monitoreo para el posicionamiento de la muestra, una platina de traducción XYZ controlada por motor paso a paso (PI miCos) y una platina de inclinación para hacer que la superficie de la muestra sea paralela a las direcciones de movimiento x e y de la platina. . Un objetivo Mitutoyo Plan Apo 10X con una apertura numérica (NA) de 0,28 y una distancia de trabajo de 34 mm enfoca los pulsos láser a un radio de haz medido de 3,5 µm (a \(1/{e}^{2}\) de intensidad) en la muestra. Con un rango de Rayleigh inferior a 12 µm, el plasma se crea en la muestra biológica delgada, produciendo una ablación mínima del material del sustrato. Las mediciones se realizaron a temperatura ambiente en una atmósfera de aire, utilizando una energía por pulso de \(7\pm 0,5 \mu \mathrm{J}\) y una intensidad máxima correspondiente de aproximadamente \(5\times {10}^{14 }\mathrm{ W}/{\mathrm{cm}}^{2}\), lo que asegura una buena relación señal-ruido con una contribución espectral muy baja del sustrato.

Representación esquemática de la configuración experimental.

Para cada ubicación seleccionada en la muestra con un tipo de tejido previamente identificado, realizamos la ablación de una matriz de 10 × 10 en un régimen de láser de un solo disparo; Después de registrar el espectro del plasma creado por cada pulso láser, la muestra se movió una distancia de punto a punto de 25 µm.

La luz emitida por el plasma inducido por láser se recogió a una NA de 0,22 mediante un sistema de dos lentes de sílice fundida colocadas a 45° cerca del objetivo del microscopio y se transportó a través de una fibra óptica hasta la rendija de entrada de 50 µm del espectrómetro (LOT Oriel Multispec MS125). Para este experimento, utilizamos una rejilla con 400 líneas/mm y 500 nm de brillo (LOT Oriel 77417), que aseguró una resolución espectral de aproximadamente 1 nm. Se conectó al espectrómetro un ICCD PIMAX PIMAX intensificado para registrar los espectros. La calibración de la longitud de onda se realizó con una lámpara de calibración (LOT Oriel Pen Ray 6035 Hg(Ar)) sin calibración de intensidad.

La adquisición de datos se sincronizó con el sistema láser. El generador de sincronización programable de la cámara controla el retraso y el tiempo de exposición (puerta) de la grabación con precisión ns. Para la emisión fs-LIBS, utilizamos un retraso de 23 ns después del pulso láser y un tiempo de puerta de 500 ns para suprimir la emisión supercontinua del pulso láser y el fondo de banda ancha de la bremsstrahlung continua. Cada espectro se guardó y se etiquetó de acuerdo con el tipo de tejido.

Se investigaron muestras de tejido de hígado humano fijado con formalina e incluido en parafina que contenían metástasis de cáncer colorrectal, tejido mamario con tumor primario y un ganglio linfático con cáncer de mama metastásico. Se prepararon secciones delgadas en serie de 10 µm de cada bloque de parafina mediante un micrótomo y la parafina se eliminó disolviéndola posteriormente con xileno, alcohol y agua de acuerdo con protocolos estándar32. Las rodajas más externas de la pila se tiñeron con un protocolo estándar H&E (hematoxilina y eosina) para identificar regiones de tejido sano y canceroso (Fig. 2a). De esta manera, cada conjunto de dos o tres portaobjetos LIBS se encapsuló con un par de portaobjetos de referencia y podemos utilizar el análisis patológico clásico mediante inspección óptica en los cortes externos teñidos para seleccionar las ubicaciones correspondientes en los cortes internos para la investigación espectral con alta certeza. Los cortes con tamaños laterales de alrededor de 2 × 1,5 cm se colocaron en un portaobjetos de microscopía. En el análisis LIBS de muestras muy finas, una cuestión importante es la elección del sustrato28, que puede presentar fuertes líneas espectrales de impurezas22. Por este motivo, hemos elegido sustratos de vidrio de cuarzo de alta pureza (Plano GmbH), donde las únicas líneas de emisión presentes en el rango espectral medido son las de silicio (Si), como se puede observar en la inserción de la Fig. 3. El silicio está presente en cantidades insignificantes en los tejidos biológicos de mama e hígado analizados33,34, eliminamos los espectros con señales significativas de Si porque estas solo pueden originarse a partir del sustrato. Otra forma de evitar problemas con el sustrato (y obtener señales más altas) serían cortes más gruesos, pero son difíciles de obtener y manipular mediante este procedimiento.

Representación esquemática de la preparación de muestras en (a) e imágenes de microscopía de los dos tipos de tejido (hígado en (b) y mama en (c)). Las marcas rojas en (b) y (c) indican regiones tumorales puras, mientras que las marcas azules muestran regiones sanas puras. Las áreas restantes contienen una mezcla de células tumorales y sanas. El recuadro en (b) muestra la imagen de una matriz extirpada superpuesta al área correspondiente en la imagen de referencia.

Espectros hepáticos preprocesados (resta de línea de base y normalización de vectores) de ambas clases (rojo = "Tumor", azul = "Saludable", incluida la distribución de señal respectiva de cada longitud de onda dentro del conjunto de datos indicado por los tonos de colores correspondientes. La inserción en la parte superior La izquierda muestra un promedio de 100 espectros registrados del sustrato vacío (cuarzo, verde) y el tejido hepático tumoral (rojo) y el de la parte superior derecha muestra una parte ampliada del espectro para una mejor visualización de la línea de Na.

La Tabla 1 presenta para cada paciente el número de muestras LIBS y el número total de espectros registrados en el tumor y las áreas sanas. Las muestras del paciente 3 son solo tejido tumoral de mama cultivado en ganglios linfáticos (no tejido mamario sano).

La Figura 2 muestra imágenes de dos diapositivas de referencia de ambos tipos de tejidos (hígado y mama). Las regiones tumorales están representadas por un color violeta oscuro (Fig. 2b yc, área marcada en rojo), mientras que las regiones sanas están indicadas por un color más claro (Fig. 2b yc, área marcada en azul). Las mediciones espectrales se limitaron a las áreas marcadas para garantizar la correcta identificación y etiquetado del tipo de tejido.

Los espectros resultantes se etiquetan con la clase correspondiente (“Tumor” o “Saludable”) para su posterior análisis. Para evitar sesgos (durante ML) basados en las condiciones experimentales, se registró un número comparable de espectros de cada tipo de tejido durante cada sesión experimental. En nuestro enfoque, el ML es una clasificación binaria y su objetivo es clasificar espectros dados en las clases de "Tumor" y "Saludable". Cabe mencionar que durante la evaluación no se considera ninguna diferenciación de estadios tumorales. La clase "Saludable" tampoco tiene en cuenta el tipo de tejido o de células, sino sólo la ausencia de células tumorales. El procesamiento de los espectros y el análisis mediante algoritmos ML se realizaron mediante la aplicación de software para minería de datos Orange versión 3.32.035.

Se recuperaron del archivo del Instituto de Patología de Nordhessen (Alemania) muestras de tejido de hígado humano fijado con formalina e incluido en parafina que contenían metástasis de cáncer colorrectal, tejido mamario con tumor primario y un ganglio linfático con cáncer de mama metastásico. cumplimiento de una votación del comité de ética para la investigación científica (proporcionado por Hessische Landesärztekammer, FF61/2014). De acuerdo con esta votación aprobada, hemos estado utilizando muestras de tejido no vital de más de 10 años que contienen un exceso de material que ya no tiene relevancia diagnóstica. En tales casos, no se necesita el consentimiento informado adicional del paciente.

Como primer paso, el entrenamiento y las pruebas del algoritmo ML se limitan a los espectros de muestras de hígado. Incluyen grandes áreas de tumor y tejido sano, dando una alta certeza para identificar y etiquetar correctamente los espectros registrados. Esto proporciona una línea de base para el desempeño de nuestro método propuesto antes de extender el análisis a casos más complejos.

Una secuencia de pasos de preprocesamiento preparó los datos adquiridos para el análisis posterior. Al principio, los espectros inadecuados se clasificaron utilizando el widget "el factor atípico local" dentro del software Orange, que mide la desviación local de un espectro registrado determinado con respecto a sus vecinos (usamos un factor de contaminación del 5% para 25 vecinos). Además, los espectros que contienen una fuerte línea espectral de Si I a 288,34 nm indican que los pulsos láser también eliminaron el sustrato de sílice fundida y todos los espectros que contienen en esta longitud de onda una señal superior a la del fondo más las fluctuaciones máximas de ruido aleatorio para este rango espectral fueron también eliminado. Para los datos restantes, se promediaron tres espectros adyacentes, lo que redujo efectivamente el conjunto de datos en un tercio. Se aplicaron resta de línea base y normalización vectorial de los espectros36 para corregir desviaciones menores del proceso de registro, como fluctuaciones en la energía de los pulsos láser. No se utilizó el rango completo de los 1024 píxeles nativos del ICCD, pero se eliminaron 30 de ellos en cada extremo debido a algunas viñetas en las esquinas del sensor CCD. Finalmente, el conjunto de datos del hígado contenía un total de 2392 espectros promediados etiquetados como "Tumor" y 2544 como "Saludable" con 964 características (píxeles que corresponden a las longitudes de onda en los espectros registrados).

Los espectros de emisión inducida por láser registrados para ambas clases se presentan en la Fig. 3. Muestran líneas atómicas37 así como bandas moleculares38. Las líneas y bandas identificadas concuerdan con los espectros de emisión de tejido biológico presentados en otras publicaciones15,16,38,39. Cabe mencionar que en el caso de fs-LIBS las líneas de emisión molecular son más fuertes que en el caso de pulsos ns, como también señalaron otros autores27,28, y que la naturaleza de estas bandas es la fragmentación de moléculas orgánicas y no la reacción del carbono con el nitrógeno en la atmósfera ambiental del laboratorio, como se analiza en la Ref.40. La doble línea de Ca II a 396,8 nm y 393,4 nm es la única contribución iónica del espectro. Una diferencia visible en los espectros (ilustrada en la Fig. 3) entre las dos categorías es la relación de intensidad de la línea de Na, pero la discriminación solo en esta línea no es tan precisa como usar algoritmos ML que consideran la información espectral completa, que puede identificarla. con más detalle y proporcionar una mejor clasificación.

La siguiente evaluación de diferentes algoritmos de ML se realizó con el estándar de validación cruzada diez veces en el conjunto de datos del hígado. El rendimiento de los algoritmos se juzga por su capacidad para detectar cada clase por separado y el porcentaje general de decisiones correctas, es decir, la precisión de clasificación (CA).

Se eligieron varios algoritmos con diferente complejidad y estructuras para analizar los datos: Naïve Bayes, árbol de decisión, máquina de vectores de soporte, K-vecinos más cercanos, bosque aleatorio y redes neuronales. Su puntuación CA está por encima de 0,85 e indica una muy buena capacidad de todos los modelos para discriminar las clases de tejido con precisión. Los tres algoritmos principales, a saber, redes neuronales artificiales (ANN), bosque aleatorio (RF) y K-vecino más cercano (KNN), se adaptaron de manera óptima al conjunto de datos ajustando sus parámetros internos para obtener el mayor porcentaje de clasificación correcta. Para ANN utilizamos 512 neuronas en una capa oculta, 250 árboles en RF y 25 vecinos para KNN. Los resultados de los algoritmos entrenados se resumen en la Fig. 4, donde los gráficos de barras representan el porcentaje de clasificación correcta. Los modelos ANN y RF pueden detectar ambas clases en el mismo nivel (con una puntuación CA de ~ 0,95), mientras que el KNN es más sensible a los tumores (puntuación CA 0,88).

Porcentajes de clasificaciones correctas utilizando Redes Neuronales Artificiales, Bosque Aleatorio y K-Vecino más cercano para tejido hepático sano y tumoral.

Los espectros presentados muestran características distintas, lo que plantea la cuestión de qué características (longitudes de onda) son relevantes para las decisiones del algoritmo. Esta sección mostrará el análisis de la importancia de la línea espectral para la discriminación.

Un enfoque sencillo para esta tarea es invertir un algoritmo de tal manera que utilice la clase (“Tumor” o “Saludable”) como entrada y calcule un “espectro inverso”, donde la intensidad de cada línea describe la importancia del decisión del algoritmo. La RF y su estructura basada en árboles de decisión permiten el cálculo de dicho “espectro inverso” mediante la disminución media de impurezas para todos los árboles (efectivamente, qué tan bueno es el conjunto de datos asignado a cada clase para cada árbol y cada longitud de onda)41. La Figura 5 muestra los resultados del cálculo. Se ve que el “espectro inverso” se parece a los registrados, aunque las intensidades de las líneas espectrales difieren significativamente. La línea de sodio tiene la mayor importancia para el proceso de decisión del algoritmo, lo cual era de esperar, ya que se observaron intensidades divergentes en los espectros registrados. El aumento de la emisión de la línea de Na en el tejido tumoral también ha sido discutido en otras publicaciones16,17 y se atribuyó al aumento intracelular de Na resultante de un cambio en la cinética de Na+/H+ en un ambiente extracelular ácido. La banda C-N tiene la segunda puntuación más alta y las segundas intensidades más altas en los espectros reales y, junto con las bandas C-C, muestra la importancia de las señales moleculares para la toma de decisiones. Sin embargo, es fundamental mencionar que estas observaciones sólo aplican al modelo RF y no necesariamente son aplicables a los demás modelos. No obstante, proporciona información sobre el proceso de toma de decisiones y muestra que los algoritmos utilizan líneas espectrales para identificar las clases.

El espectro inverso (puntuación de importancia para cada longitud de onda) del algoritmo Random Forest se superpuso con los espectros de emisión registrados promediados para el tumor hepático.

Destacamos que el uso de pulsos ultracortos en LIBS también permite el uso de bandas de emisión molecular en el análisis, a diferencia de ns-LIBS, donde la diferenciación se basa principalmente en líneas atómicas e iónicas. Reducir la dimensionalidad de los espectros42 utilizando como entrada en ML diferentes combinaciones de líneas atómicas o bandas moleculares genera una CA más baja que usar toda la información espectral (resultados que no están dentro del alcance de este trabajo), por lo que nuestra prueba se centrará en mejores clasificaciones.

Después de observar la capacidad de los algoritmos ML para identificar con precisión el tejido tumoral y demostrar que la toma de decisiones se basa en líneas espectrales con distintos grados de importancia, el siguiente paso es investigar la reproducibilidad de fs-LIBS y comprobar su aplicación como herramienta analítica. . Los procesos de ablación son complejos y sensibles a diversos parámetros externos. Esta complejidad aumenta aún más para las investigaciones LIBS sobre tejido biológico, ya que su composición elemental es muy heterogénea. Para evitar este problema, en muchos estudios se utilizan puntos focales amplios para la irradiación, reduciendo así la resolución espacial y aumentando el daño colateral13,43,44,45, o utilizan una gran cantidad de espectros para promediar14,15,18. Fs-LIBS tiene la ventaja de registrar espectros más reproducibles en comparación con el ns-LIBS tradicional debido a su naturaleza determinista de ionización y la ausencia de interacción láser-plasma durante el pulso láser. El aspecto de reproducibilidad y coherencia del conjunto de datos se aborda de la siguiente manera: en la misma muestra de tejido hepático, realizamos mediciones en tres días diferentes donde optimizamos la configuración para cada día individualmente. Por lo tanto, lo ideal es que los espectros sean los mismos, asumiendo que cada material extirpado dentro de un tipo de tejido contiene la misma composición elemental. En consecuencia, entrenar algoritmos de ML en los espectros registrados en un día y probarlos en los de otro día debería producir los mismos resultados. Así, los tres modelos optimizados, KNN, RF y ANN, se probaron para todas las combinaciones posibles de los tres subconjuntos de espectros diarios. Todos estos algoritmos muestran una buena reproducibilidad en el día a día, con porcentajes de clasificación correcta superiores al 75% y a continuación comentaremos los resultados obtenidos utilizando RF. La Figura 6 muestra las predicciones correctas para las clases Tumor y Saludable utilizando el algoritmo de RF.

Reproducibilidad de las mediciones en tejido hepático. Porcentaje de clasificaciones correctas cuando el algoritmo Random Forest se entrenó en un día y se probó con los datos medidos en un día diferente.

Las diferentes barras muestran una desviación visible del rendimiento del algoritmo. Por ejemplo, la capacidad de RF para detectar tejido tumoral varía en el caso de "Día de entrenamiento 1-Día de prueba 2" versus "Día de entrenamiento 1-Día de prueba 3" en aproximadamente un 20%. Sin embargo, se esperan desviaciones ya que muchos factores, como ajustes ligeramente diferentes de la configuración y la falta de homogeneidad del tejido biológico, afectarán el rendimiento de los modelos. Además, el modelo puede identificar con precisión cada clase con porcentajes superiores al 75 % y puntuaciones CA consistentes (no se muestran aquí) superiores a 0,88, lo que indica coherencia dentro del conjunto de datos.

El tejido mamario es uno de los más heterogéneos46. En las muestras patológicas que analizamos, las áreas con clara identificación del tumor y del tejido sano eran más pequeñas que en el caso del tejido hepático (como se ve en la Fig. 2). Esto dificultó el procedimiento de medición y aumentó la posibilidad de etiquetado incorrecto. Las muestras de mama provinieron de tres pacientes diferentes y, por lo tanto, nos permitieron investigar el aspecto de la generalización en comparación con el conjunto de datos de hígado, que era solo de un paciente. Los espectros del tumor de mama y del tejido sano son similares a los del hígado y se muestran en la Fig. 7.

Espectros mamarios preprocesados (resta de línea de base y normalización de vectores) de ambas clases (rojo = Tumor, azul = Saludable), incluida la distribución de señal respectiva de cada longitud de onda dentro del conjunto de datos (sombras de colores). La inserción en la parte superior derecha muestra una parte ampliada del espectro para una mejor visualización de la línea de Na.

La asignación de líneas y bandas espectrales, así como el preprocesamiento, la selección del modelo y el ajuste fino, se realizaron de manera análoga al conjunto de datos del hígado. Los tres modelos optimizados (KNN, RF y ANN) funcionan a un nivel muy alto con puntuaciones CA consistentes por encima de 0,85 (KNN = 0,85, RF = 0,92 y ANN = 0,91) cuando se analiza todo el conjunto de espectros de los tres pacientes.

En el sentido de generalización, probamos la capacidad de los algoritmos para clasificar correctamente nuevos datos procedentes de pacientes desconocidos. Dentro de la escala de este proyecto, utilizamos el conjunto de datos de los dos pacientes con tumores primarios para el proceso de capacitación y probamos la capacidad de los algoritmos para identificar el tumor con metástasis en el tercer paciente. El grupo de entrenamiento constaba de espectros de ambas clases, mientras que el conjunto de prueba contenía sólo espectros de tejido tumoral. Utilizamos los espectros 1985 Tumor y 2558 Healthy para la fase de entrenamiento, mientras que la prueba en el nuevo paciente se realizó en los espectros 1590 Tumor. La Figura 8 muestra los resultados de las clasificaciones correctas de los tres modelos.

Porcentajes de clasificaciones correctas de metástasis cuando los algoritmos se entrenaron en tumores primarios de otros pacientes.

El porcentaje de 99,9 (KNN y RF) y 99,7 (ANN) muestra una tasa de predicción sorprendentemente excelente y sugiere potencial para la generalización. Sin embargo, dado que el grupo de entrenamiento estaba formado por dos pacientes y el grupo de prueba de un paciente con células de cáncer de mama en los ganglios linfáticos, se necesita un grupo más grande de pacientes para llegar a conclusiones más definitivas.

Se ha demostrado que fs-LIBS se puede utilizar con muestras muy finas sobre un sustrato de vidrio de cuarzo y que la señal producida es lo suficientemente fuerte como para diferenciar el tejido hepático tumoral del sano con una alta resolución espacial. Identificamos correctamente el tipo de tejido utilizando una combinación de cortes LIBS y de referencia cortados con microtomo adyacentes. Los algoritmos Random Forest y Artificial Neural Networks obtuvieron los mejores resultados, clasificando correctamente tanto el tejido hepático tumoral como el sano en más del 94% de los casos. En este caso, el algoritmo K-Nearest Neighbor produjo una excelente identificación del tejido tumoral, pero tuvo resultados modestos en el caso del tejido sano. Utilizando el algoritmo de RF, se calculó la importancia de la característica, lo que llevó a la conclusión de que las bandas moleculares y la línea de sodio tienen prioridad en el proceso de decisión. La presencia de líneas moleculares representa una de las ventajas del uso de láseres ultracortos, que producen una buena firma espectral después de la ablación con pulsos de baja energía. Esto evita la disociación masiva del material biológico molecular como en el caso de los pulsos de láser ns, donde la discriminación del tipo de tejido se basa únicamente en las líneas atómicas o iónicas20,22,43. Se exploró la posibilidad de utilizar esta técnica en un paciente nuevo y desconocido en muestras de mama con muy buena precisión de clasificación.

En el futuro, además de aumentar el número de pacientes y estudiar la influencia de la preparación de la muestra, queremos investigar la dependencia de la longitud del pulso para la diferenciación de tejidos. Para aumentar aún más la precisión de la identificación, además de mejorar la relación señal-ruido mediante el uso de pulsos de femtosegundos con doble retardo25, se utilizarán algoritmos numéricos más complejos47. Las posibles aplicaciones en el campo intraoperatorio deberían considerar la disponibilidad de fuentes láser, donde los láseres de fibra de alta tasa de repetición con duraciones de pulso más largas parecen ser prometedores48 y también pueden integrarse fácilmente en dispositivos endoscópicos.

Esperamos que este método pueda utilizarse in situ/in vivo como método complementario al análisis patológico estándar.

Teniendo en cuenta la precisión espacial de la ablación con pulsos de láser de femtosegundos y el bajo volumen de muestra requerido, creemos que se podría obtener información intraquirúrgica sobre la naturaleza y extensión del tumor después de que los algoritmos de identificación se entrenaron en muestras de biopsia del mismo paciente. En un futuro lejano, cuando los láseres fs puedan usarse como herramientas quirúrgicas, este método podría ayudar a distinguir el tejido sano del enfermo directamente durante la incisión.

Los conjuntos de datos durante y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores desean agradecer a Sabrina Schuster, Andreea Cojocaru, Arne Ungeheur y el Dr. Vladimir Gross de la Universidad de Kassel por la ayuda en la mejora de la configuración experimental y los métodos de análisis. PD Dr. med. Kia Homayounfar de la clínica Kassel, Dr. med. Hannah Fahrner y el Dr. rer. nat. Matthias Fahrner de la Universidad de Friburgo agradecemos las útiles discusiones.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Los autores declaran que no se utilizó financiación externa.

Instituto de Física, Universidad de Kassel, Heinrich-Plett-Str. 40, 34132, Kassel, Alemania

Cristian Sarpe, Elena Ramela Ciobotea, Christoph Burghard Morscher, Bastian Zielinski, Hendrike Braun, Arne Senftleben y Thomas Baumert

Instituto de Patología del Norte de Hesse, Germaniastr. 7, 34119, Kassel, Alemania

Josef Ruschoff

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CS, ERC y CBM realizaron las mediciones y escribieron el manuscrito; ERC, CBM y BZ analizaron los datos. Todos los autores contribuyeron con discusiones críticas, leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Thomas Baumert.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Sarpe, C., Ciobotea, ER, Morscher, CB et al. Identificación de tejido tumoral en muestras patológicas delgadas mediante espectroscopia de degradación inducida por láser de femtosegundo y aprendizaje automático. Informe científico 13, 9250 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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Recibido: 23 de enero de 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 08 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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