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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10093 (2023) Citar este artículo

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La biología definitoria que distingue las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) de otras formas de muerte celular aún no está resuelta, y las técnicas que identifican inequívocamente las NET siguen siendo difíciles de alcanzar. La medición de dispersión Raman proporciona una visión general holística de la composición molecular celular basada en vibraciones de enlace características en componentes como lípidos y proteínas. Recopilamos espectros Raman de NET y congelamos/descongelamos células necróticas utilizando una plataforma de alto rendimiento personalizada que puede medir rápidamente espectros de células individuales. El análisis de componentes principales de los espectros Raman de NET los distinguió claramente de las células necróticas a pesar de su morfología similar, lo que demuestra sus diferencias moleculares fundamentales. Por el contrario, las técnicas clásicas utilizadas para el análisis NET, la microscopía de inmunofluorescencia, el ADN extracelular y el ELISA no pudieron diferenciar estas células. Además, el análisis de aprendizaje automático de los espectros Raman indicó diferencias sutiles en los NET inducidos por lipopolisacáridos (LPS) en comparación con los inducidos por miristato acetato de forbol (PMA), lo que demuestra que la composición molecular de los NET varía según el estimulante utilizado. Este estudio demuestra los beneficios de la microscopía Raman para discriminar los NET de otros tipos de muerte celular y por su vía de inducción.

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son una forma de muerte celular caracterizada por la descomposición del núcleo y la liberación de ADN en una estructura similar a una nube o una cuerda1,2. Debido a su naturaleza delicada y variada, el desarrollo de técnicas específicas y sencillas para la caracterización de los TNE ha sido difícil3,4. Aunque una gran cantidad de investigaciones han demostrado que la formación de NET es una forma controlada y distinta de muerte celular2,5, existe una superposición significativa con otras vías de muerte celular y la definición exacta de NET está bajo debate4. La descondensación y liberación del ADN distingue los NET de procesos como la apoptosis, la necroptosis y la piroptosis, todos los cuales dan como resultado la condensación nuclear6,7. Sin embargo, las etapas posteriores de muchas vías de muerte celular pueden provocar la descomposición del núcleo y la liberación de ADN, lo que podría confundir el análisis de los criterios de valoración. Por ejemplo, la necrosis secundaria, que se produce después de la apoptosis, provoca la descondensación del ADN, la lisis celular y la liberación de contenidos extracelulares8,9,10. Además, la muerte celular no regulada, como la necrosis causada directamente por daño fisiológico a las células, puede dar como resultado características notablemente similares a la formación de NET11,12. Es fundamental distinguir estos tipos de muerte celular para comprender qué vías se activan para causar la muerte celular, cómo se pueden controlar para mitigar posibles resultados patológicos y si la muerte celular es el resultado de agresiones fisiológicas o estrés a las células durante el proceso. procedimientos experimentales o es una auténtica vía de muerte celular programada6.

La detección y cuantificación de NET generalmente se basa en una combinación de medición de ADN extracelular, morfología celular y marcadores de proteínas, siendo los más comunes la mieloperoxidasa (MPO), la elastasa de neutrófilos (NE) y las histonas citrulinadas. La medición del ADN extracelular utiliza tintes fluorescentes, como PicoGreen2, para medir el ADN liberado en el sobrenadante. Los tintes de ADN impermeables, como Sytox Green, también se utilizan a menudo para teñir NET, excluyendo al mismo tiempo las células con una membrana intacta, lo que permite la cuantificación mediante técnicas como la citometría de flujo13,14,15. Si bien son fáciles de implementar, estas técnicas tienen limitaciones debido a su incapacidad para distinguir los NET de otras formas de muerte celular. El análisis morfológico mejora esto, pero requiere imágenes seguidas de un recuento manual o un procesamiento automatizado de imágenes16,17,18,19,20. Esto puede resultar laborioso e introducir sesgos, por lo que a menudo se introducen marcadores de proteínas en un esfuerzo por mejorar la precisión. Además de ayudar a las técnicas de imagen, los marcadores proteicos se utilizan en ELISA tipo sándwich, en los que los NET se inmovilizan utilizando anticuerpos proteicos, comúnmente anti-MPO, y se detectan mediante anticuerpos para el ADN (o viceversa)21,22,23.

Una alternativa al uso de marcadores proteicos específicos para el análisis celular es un interrogatorio no supervisado del contenido molecular celular total. Esto puede alcanzar niveles más profundos de caracterización y revelar características distintivas que no se habían considerado anteriormente. La espectroscopia Raman detecta patrones de dispersión láser producidos a través de vibraciones de enlaces moleculares, y los avances recientes en la microscopía espectral Raman sin etiquetas permiten interrogar el contenido molecular con resolución unicelular, en cultivos de células vivas24,25. Los datos complejos de alto nivel producidos a través de Raman requieren técnicas de análisis acordes, como la reducción de dimensionalidad mediante análisis de componentes principales (PCA) o aprendizaje automático, para identificar diferencias espectrales críticas entre muestras complejas. De esta manera, Raman se puede utilizar para clasificar estados celulares, como macrófagos activados versus en reposo24, o tipos de células, como macrófagos residentes versus infiltrados26, y células cancerosas versus sanas27; sin requerir marcadores proteicos específicos. La espectroscopia Raman ha tenido menos aplicaciones en estudios de neutrófilos, que son más pequeños y pueden ser más difíciles de medir. Sin embargo, se han informado algunas demostraciones importantes del poder del análisis basado en Raman: detección de alto rendimiento de una variedad de glóbulos blancos, incluidos los neutrófilos28, con informes de subtipificación de leucocitos29. La activación30,31 y la diferenciación32 de los neutrófilos también se han rastreado mediante análisis Raman. Además del fenotipado y la caracterización de los estados celulares, la espectroscopia Raman también puede arrojar luz sobre funciones moleculares más específicas en los neutrófilos, como las asociaciones de los cuerpos lipídicos con la función celular33.

En este estudio utilizamos necrosis por congelación/descongelación, que resultó en una morfología similar a la de los NET, como base para probar la capacidad de la microscopía Raman para discriminar los NET de las células necróticas. A pesar de la incapacidad de las técnicas tradicionales para distinguir estas células, demostramos claras diferencias espectroscópicas en la señal Raman, lo que indica diferencias moleculares a nivel de base en estos tipos de células. Utilizamos PCA para limitar las características Raman clave que separan estos tipos de células y permiten la clasificación. Además, realizamos análisis utilizando aprendizaje automático basado en regresión logística para mostrar que los NET producidos por diferentes estímulos se pueden distinguir por su huella espectroscópica Raman. En general, proporcionamos una comprensión más profunda de las diferencias entre necrosis y diferentes tipos de formación de NET, destacando las diferencias moleculares que pueden identificarse claramente mediante microscopía Raman, proporcionando así un enfoque importante para el análisis de NET.

Primero evaluamos la capacidad de las técnicas convencionales para distinguir los NET de los neutrófilos necróticos. Indujimos NET utilizando dos estímulos modelo, acetato de miristato de forbol (PMA) y lipopolisacárido (LPS), mientras que para inducir necrosis utilizamos una ronda de congelación/descongelación a -80 °C, que encontramos que produjo células necróticas similares en apariencia a los NET. Analizamos las células mediante microscopía de inmunofluorescencia, cuantificación de ADN PicoGreen y ELISA complejo ADN/MPO, de acuerdo con protocolos ampliamente adoptados.

Para la microscopía de inmunofluorescencia, utilizamos tintes de ADN permeables e impermeables Hoechst y Sytox Green, combinados con un anticuerpo anti-MPO fluorescente (Fig. 1A). Los NET se presentaron como grandes estructuras de ADN en forma de nubes difusas, que se ubicaron conjuntamente con la tinción con MPO, sin diferencias inmediatamente evidentes entre los NET inducidos por PMA y LPS. Las células necróticas mostraron una nube similar a la morfología del ADN y, lo que es más importante, las células necróticas también se tiñeron intensamente con MPO colocalizada con el ADN. Un control de isotipo para el anticuerpo MPO utilizado dio poca señal, lo que indica que es poco probable una adsorción no específica del anticuerpo (Supp. Fig. 1A). El enmascaramiento y la cuantificación automatizados del área celular, y la intensidad de la tinción con Sytox Green y MPO (características celulares comúnmente utilizadas para el análisis NET), mostraron que, aunque había diferencias significativas entre los grupos, estas características se superponían en gran medida entre los NET y las células necróticas (Suplemento Fig. 2). .

Limitaciones de la morfología del ADN y los enfoques de marcadores de proteínas únicas para distinguir la necrosis de la formación de NET. Imágenes representativas de neutrófilos tratados simuladamente, NET inducidos por LPS (10 μg/ml), NET inducidos por PMA (100 nM) y células necróticas (congelación/descongelación) teñidas con Hoechst (cian), Sytox Green (SYG, verde). y anticuerpo antimieloperoxidasa conjugado con PE (MPO, rojo) después de 4 h de incubación a 37 °C, fotografiado directamente en los pocillos de la placa sin lavado (A). Tenga en cuenta que la intensidad de Hoechst está optimizada para la visualización de la muestra simulada, lo que hace que su señal sea imperceptible para los NET y las células necróticas que tienen una densidad de ADN mucho menor. La barra de escala es de 25 μm. El ADN recolectado mediante lavado inicial y luego levantado de la superficie mediante digestión parcial con nucleasa, se cuantificó mediante fluorescencia PicoGreen para el ADN total (B) y mediante ELISA de captura anti-MPO y detección de anti-ADN para complejos MPO/ADN (C). Los puntos de datos representan experimentos independientes en diferentes días con diferentes donantes. ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, según lo determinado por ANOVA con la prueba post hoc de Tukey.

A continuación, utilizamos la fluorescencia PicoGreen, un indicador de la formación de NET basado en la liberación de ADN extracelular. Este ensayo se puede realizar en el ADN liberado directamente en el sobrenadante o en el ADN liberado de la superficie después de la agitación y/o la digestión parcial con nucleasa. Los experimentos preliminares indicaron que la digestión parcial con nucleasa microcócica dio los resultados más consistentes y, por lo tanto, adoptamos este enfoque. Como lo indica la intensidad de fluorescencia de PicoGreen, la necrosis y ambos tipos de inducción de NET dieron como resultado una liberación sólida de ADN en comparación con la simulación, pero no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados (Fig. 1B). Esto indica que el ADN de la necrosis por congelación/descongelación permanece adherido a la superficie durante el lavado y se libera mediante digestión con nucleasa de manera similar a los NET.

Finalmente, analizamos muestras mediante ELISA complejo ADN/MPO. Este enfoque es similar al enfoque PicoGreen; sin embargo, generalmente se considera un marcador más específico de la formación de NET dado que solo se miden los complejos ADN/MPO, en lugar del ADN total. A pesar de esto, las células necróticas y los NET produjeron niveles equivalentes de complejos ADN/MPO (Fig. 1C). Para abordar cualquier posible adsorción no específica, se usó un control de isotipo en lugar del anticuerpo de captura anti-MPO; sin embargo, no se detectó ninguna señal apreciable (Supp. Fig. 1B). En general, demostramos que distinguir los NET de las células necróticas congeladas/descongeladas es problemático utilizando técnicas convencionales.

Como se muestra arriba, demostramos que la identificación de NET utilizando la morfología del ADN o un único marcador proteico puede ser un desafío. Un enfoque alternativo es realizar un estudio general de las características de las células moleculares, lo que logramos mediante microscopía Raman. Los NET y las células necróticas se indujeron de la misma manera que anteriormente. Las células se interrogaron utilizando una plataforma óptica personalizada que combina fluorescencia y espectroscopía Raman que hemos descrito anteriormente24 (Fig. 2). Debido a su limitado contraste de campo claro, no fue posible identificar la ubicación de los NET sin marcar y, por lo tanto, fue necesario incluir un marcador de fluorescencia de ADN, Helix NP Blue, que confirmamos que no interfería con la señal Raman (Supp. Fig. 3). Los NET y las células necróticas se identificaron basándose en un área grande y una señal Helix NP Blue de baja intensidad, lo que indica una nube difusa de ADN típica de los NET.

Mediciones Raman unicelulares de NET y células necróticas de congelación/descongelación utilizando una plataforma óptica multimodal. Las células se ubican espacialmente utilizando el marcador fluorescente Helix NP Blue. La barra de escala es de 25 μm. Luego se utilizan espejos giratorios y se mueve rápidamente un láser a través del área central de una sola celda utilizando espejos de escaneo híbridos, de los cuales se recopila el espectro de dispersión Raman.

Los espectros Raman promedio, corregidos con la línea de base mediante spline cúbico, se muestran de cada grupo de tratamiento (Fig. 3A, B). Debido a la corrección de referencia, algunas partes de los espectros parecen negativas; sin embargo, las posiciones y intensidades de los picos son comparables en todos los conjuntos de datos. Los espectros resultantes son típicos de células inmunes vivas, y los espectros consisten principalmente en bandas relacionadas con proteínas y lípidos, con algunas contribuciones más pequeñas de otras moléculas celulares como el ADN y el ARN. En la Tabla 1 se dan más detalles sobre los orígenes de estas bandas. Los espectros Raman promedio de los NET inducidos por LPS y PMA son casi idénticos entre sí, mostrando una marcada pérdida de contenido biológico en comparación con las células no tratadas, mientras que el espectro Raman promedio de los neutrófilos necróticos también muestra una pérdida notable de contenido biológico, aunque no tan grave (Fig. 3A, B). Las principales diferencias entre las células necróticas y los NET incluyen una reducción en la contribución del sustrato de cuarzo y una mayor contribución de proteínas y lípidos. En general, los resultados sugieren que cuando se forman NET, los neutrófilos sufren una pérdida dramática de contenido celular, y el material restante contribuye a los espectros Raman predominantemente a base de proteínas. Las células necróticas también pierden una cantidad significativa del material que contribuye a sus espectros Raman, pero parecen retener más contenido de lípidos.

El análisis de componentes principales de las características espectrográficas Raman resalta las principales diferencias moleculares entre las células necróticas y las NET. Espectros Raman unicelulares promedio corregidos con la línea base para cada grupo de tratamiento, trazados por separado con la desviación estándar representada por la región sombreada (A) o superpuestos en un gráfico (B). Gráfico de puntuaciones (C), varianza explicada por cada componente (D) y vector de carga para PC1 (E) para el análisis de componentes principales (PCA) de LPS, PMA y espectros Raman de células necróticas.

Para explorar las principales contribuciones a la varianza en el conjunto de datos, realizamos PCA de espectros Raman obtenidos de células necróticas y NET. La mayor cantidad de variación en el conjunto de datos (PC1, 57%) divide los datos en dos poblaciones claramente separadas que consisten en células necróticas, con valores de PC1 en gran medida positivos, y NET, que dan valores negativos (Fig. 3C, D). El vector de carga para PC1 se muestra (Fig. 3E) con contribuciones espectrales candidatas resumidas en la Tabla 1. En general, en comparación con las células necróticas, los NET inducidos por LPS y PMA tienen mayores contribuciones del cuarzo y de la columna vertebral de la proteína (banda en ~ 1049 cm-1) 34 y vibraciones H – C = C (banda a ~ 3003 cm-1) 35 que sugieren que la presencia de cadenas de ácidos grasos insaturados están más fuertemente asociadas con los NET.

Para explorar específicamente las diferencias entre los NET inducidos por LPS y PMA, se realizó una segunda PCA con los datos necróticos excluidos. Si bien los gráficos de puntuaciones de PC muestran que es difícil separar los dos tipos de tratamiento, existen algunas pequeñas diferencias en PC1, PC2 y PC5 (Fig. 4A, B). Para calcular el poder de separación entre los grupos de tratamiento para cada PC, calculamos F- valores utilizando ANOVA como se describió anteriormente26 (Fig. 4C). PC1 fue el más alto, lo que indica que este PC proporciona la mejor separación general de los dos grupos de tratamiento. PC7 y PC10 mostraron los siguientes valores F más altos, y los representamos frente a PC1 (Supp. Fig. 4); sin embargo, estas PC eran muy similares entre los dos grupos y sus vectores de carga no eran biológicamente informativos (Supp. Fig. 5). Se muestran los vectores de carga para las PC que explican la mayor parte de la varianza y las diferencias de población, PC1, PC2, PC5 (Fig. 4D), con las contribuciones de las bandas resumidas en la Tabla 1. En general, debido a la similitud espectral entre LPS y PMA NET, PCA No fue capaz de distinguir entre las dos poblaciones.

El análisis de componentes principales no pudo distinguir los NET inducidos por PMA y LPS. Gráfico de puntuaciones (A) y varianza explicada por cada componente (B) para el análisis de componentes principales (PCA) de los espectros Raman de NET inducidos por LPS y PMA. Las líneas de contorno representan los percentiles 50 y 90 del conjunto de datos, con N = 1332 NET de LPS y N = 1458 NET de células tratadas con PMA. Valores de la prueba F por grupo de tratamiento que indican el poder de separación para cada PC (C). Carga de vectores para PC1, PC2, PC5, con otras PC que se muestran en la figura complementaria 4.

Para determinar si existen diferencias moleculares finas entre los NET inducidos por LPS y PMA detectados en los espectros Raman que no se detectaron en el análisis PCA, utilizamos aprendizaje automático supervisado basado en un modelo de regresión logística penalizada24,26. Este método utiliza espectros corregidos con la línea base, pero no espectros procesados ​​por PCA. Intenta identificar solo los parámetros espectrales más útiles basándose en la precisión de la clasificación utilizando un conjunto de datos de entrenamiento etiquetado. Los parámetros que no mejoran significativamente la precisión de la clasificación se eliminan utilizando el enfoque de lazo, que reduce estos parámetros a cero mediante la introducción de un término de penalización en el algoritmo.

Los datos se dividieron aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento que comprende el 80% de las muestras en las que se proporciona información del grupo de tratamiento al modelo, y un conjunto de pruebas que contiene el 20% restante a partir del cual el modelo intenta clasificar muestras sin conocimiento a priori de su tratamiento. El modelo identificó con precisión el 77% y el 87% de los NET inducidos por LPS y PMA, respectivamente, en el conjunto de datos de prueba (Fig. 5A-C), lo que indica que existen diferencias moleculares sutiles pero consistentes entre los NET, y que estas diferencias pueden detectarse de manera confiable en nuestras medidas Raman. Las características espectrales utilizadas en el modelo se representan mediante el vector de separación (Fig. 5D). A pesar de los intentos del modelo de realizar una reducción de parámetros, el vector de separación sigue siendo muy complejo y difícil de interpretar. Esto indica que la clasificación requiere un gran conjunto de información molecular para descubrir las diferencias consistentes en los dos grupos de tratamiento. En general, demostramos que a pesar de espectros muy similares en LPS y NET inducidos por PMA, existen diferencias complejas y de pequeña escala entre estos grupos de tratamiento que pueden detectarse ajustando la clasificación mediante el aprendizaje automático supervisado.

El aprendizaje automático revela diferencias moleculares que discriminan los NET inducidos por PMA y LPS. Puntuaciones de probabilidad para cada celda en el conjunto de datos de entrenamiento y prueba (A). Matrices de confusión que muestran la precisión de la predicción (B) y curva ROC que muestra la especificidad y sensibilidad del modelo (C). Vector de separación utilizado para la clasificación (D). Para el conjunto de datos de entrenamiento, N = 1060 para los tratados con LPS y N = 1172 para los tratados con PMA. Para el conjunto de datos de prueba, N = 272 para los tratados con LPS y N = 286 para los tratados con PMA.

La necesidad de técnicas que distingan inequívocamente los NET de otras formas de muerte celular se enumeró como una de las cuatro cuestiones clave en la investigación de los NET en un panel de revisión reciente4. Este estudio destaca la utilidad de la microscopía Raman para discriminar diferencias moleculares entre NET y células necróticas, así como entre NET producidas por diferentes estímulos. Demostramos que estas diferencias sutiles pueden ser difíciles de detectar utilizando métodos convencionales, como la microscopía de inmunofluorescencia o ELISA, enfatizando las limitaciones del uso de biomarcadores seleccionados para la cuantificación de NET y los beneficios de un enfoque holístico como la microscopía Raman.

Antes de aplicar un enfoque Raman, probamos la capacidad de tres técnicas comunes para distinguir las NET de las células necróticas: cuantificación de ADN con PicoGreen, MPO/DNA ELISA y microscopía de inmunofluorescencia. Los protocolos estándar para los ensayos PicoGreen y MPO ELISA incluyen un paso de lavado inicial para eliminar el ADN degradado y necrótico, seguido de una digestión parcial con nucleasa para liberar el ADN NET que queda adherido al sustrato22. Seguimos este protocolo, sin embargo, en comparación con la formación de NET, la necrosis básica inducida por congelación/descongelación dio como resultado niveles similares de ADN retenido en el sustrato y liberado durante la digestión con nucleasa. Es importante destacar que esto fue válido para el ADN detectado directamente mediante fluorescencia PicoGreen, o en complejo con MPO y detectado mediante ELISA. Curiosamente, se han descrito las propiedades de unión al ADN de la MPO36, y parece plausible que la MPO forme naturalmente un complejo con el ADN cuando estas moléculas entren en contacto. En apoyo de esto, la alteración directa de las membranas celulares de los neutrófilos mediante electropermeabilización da como resultado la liberación de MPO en un complejo con ADN que se asemeja a los NET12. Por el contrario, otros estudios indican que los neutrófilos apoptóticos inducidos por TNF-α21,23 y los neutrófilos necróticos inducidos por sonicación21 no dan como resultado una formación medible de complejos MPO/ADN. Una razón para esto podría ser que estas formas de muerte celular no liberan cantidades significativas de ADN fuera de la célula o, en el caso de la sonicación, tal vez los complejos ADN/MPO estén alterados. Otra explicación plausible es que en nuestro protocolo, las células necróticas se incubaron a 4 h a 37 ° C (la misma cantidad de tiempo que la inducción NET), y quizás este tiempo sea necesario para que MPO forme un complejo con el ADN.

También examinamos las células mediante microscopía de inmunofluorescencia. Si bien la morfología y la intensidad de la tinción de las células necróticas y los NET fueron bastante similares, incluida la tinción con anticuerpo MPO fluorescente, hubo diferencias sutiles que se pudieron detectar al compararlas una al lado de la otra. Si bien estos podrían usarse para discriminar los NET con precisión, estarían sujetos a sesgos y variaciones en la preparación de las muestras4,37, y las técnicas automatizadas actuales basadas en gran medida en el tamaño y la extensión de la tinción verde Sytox probablemente no serían lo suficientemente sofisticadas para clasificar las células basándose en estas diferencias17,18,38,39,40. Los algoritmos de aprendizaje profundo pueden centrarse en diferencias sutiles de imágenes para clasificar las células y han tenido éxito en distinguir las células necróticas congeladas/descongeladas, similares a las que se presentan aquí, de las NET11. Estos modelos aún se encuentran en las primeras etapas de desarrollo y se basan en conjuntos de datos grandes y consistentes. Dada la variabilidad antes mencionada en la morfología de los NET, queda por ver si serán factibles como técnica general para cuantificar los NET.

A diferencia de las técnicas convencionales, la microscopía Raman podría detectar claramente diferencias entre los NET y las células necróticas. El análisis PCA simple, que se basa únicamente en la variación de datos intrínsecos de forma no supervisada, pudo separar estos tipos de células en dos poblaciones distintas según la señal Raman. Esto permite la discriminación de los NET de la necrosis de forma imparcial y altamente específica, sin emplear algoritmos complejos basados ​​en el aprendizaje profundo y sin depender de la tinción de marcadores proteicos potencialmente no específicos. No es posible extraer las diferencias moleculares exactas del complejo espectro Raman entremezclado de cada tipo de célula; sin embargo, se pueden examinar algunas diferencias generales. Las células necróticas parecen contener cantidades relativamente mayores de material celular en comparación con los NET; en particular, contienen niveles más altos de lípidos. Esto es una indicación de que la formación de NET da como resultado un desmontaje más completo de las membranas celulares, lo que está en consonancia con los mecanismos biológicos que se sabe que son necesarios para la formación de NET, como la actividad de Gasdermin D41. En particular, aunque el ADN generalmente se considera el componente principal de los NET, la densidad real del ADN es mucho menor que la contenida dentro del núcleo celular y, en última instancia, esta falta de densidad da como resultado una señal Raman por debajo del límite de detección en nuestro sistema. En general, debido a su naturaleza difusa, la señal Raman producida por los NET es relativamente baja. A pesar de esto, nuestro sistema es capaz de detectar diferencias claras entre los NET y las células necróticas congeladas/descongeladas, que son difíciles de distinguir utilizando métodos bioquímicos y de imágenes estándar. Llevando esto un paso más allá, nuestro sistema también pudo distinguir los NET en función de su vía de inducción.

Los NET inducidos por PMA y LPS produjeron firmas espectrales Raman marcadamente similares. Las diferencias entre estos eran demasiado pequeñas para que la PCA las detectara. Los enfoques de aprendizaje supervisado, en los que los algoritmos están dirigidos a diferenciar activamente dos clases, ofrecen un enfoque mucho más poderoso para clasificar tipos de células. Nuestro modelo de regresión logística pudo lograr un alto nivel de precisión en un conjunto de datos de prueba, categorizando correctamente las células aproximadamente el 80% de las veces e indicando que existen diferencias biológicas sutiles pero consistentes entre los NET inducidos por PMA y LPS. En consonancia con esto, los estudios proteómicos de los NET han mostrado diferencias entre los NET inducidos por PMA y LPS42. La PMA ha sido criticada por su falta de relevancia biológica y nuestros datos respaldan la idea de que los PMA NET son considerablemente diferentes de los inducidos por LPS. Es posible que estas diferencias afecten la actividad de los NET en otras células y tejidos.

Una limitación de este estudio es que solo recopilamos datos de necrosis en muerte celular no programada (mediante congelación/descongelación de células), en lugar de muerte celular programada, como la apoptosis. Hubieron dos razones para esto. En primer lugar, deseábamos obtener una población de células que mostraran propiedades y apariencia similares a las de las NET, pero que claramente no fueran un tipo de formación de NET. La mayoría de los tipos de muerte celular programada implican condensación de ADN y una morfología que se puede distinguir fácilmente de los NET, aunque esto es menos frecuente en la necrosis secundaria, en la que las células muertas pueden comenzar a descomponerse y parecerse más a los NET8,9,10. En segundo lugar, las vías exactas y la definición de los NET aún se debaten4,43, y las respuestas de los neutrófilos a los estímulos pueden ser heterogéneas. También se ha informado que muchos tipos de estimulantes que inducen un tipo particular de muerte celular inducen NET. Por ejemplo, el TNF-α induce la apoptosis de neutrófilos44, pero también se ha informado que induce NET45. No está claro si los NET informados por la estimulación con TNF-α son células apoptóticas que han sufrido necrosis secundaria, o si la necrosis secundaria debe considerarse un tipo de formación de NET según las definiciones actuales6.

En general, demostramos que con un sistema suficientemente sensible, es posible recolectar espectros Raman de células individuales de NET que pueden actuar como una huella molecular para cada célula. Esta recolección es mínimamente invasiva, requiere poca preparación de la muestra y tiene un rendimiento relativamente alto y un costo bajo. A diferencia de las técnicas clásicas utilizadas para la cuantificación de NET, esta técnica discrimina fácilmente las células necróticas de las NET, destacando las claras diferencias moleculares resultantes del proceso distinto de formación de NET en contraposición a la muerte celular no regulada. La exploración profunda de la compleja información Raman recopilada de las células mediante el aprendizaje automático puede revelar diferencias moleculares sutiles en los NET determinadas por su ruta de inducción. Estas diferencias de firma molecular apuntan a una diferencia fundamental entre estos NET que podría tener importancia en futuros estudios relacionados con las consecuencias posteriores de la formación de NET y otras áreas.

Se recogieron muestras de sangre de tres voluntarios sanos en siete experimentos (dos veces del donante A, cuatro veces del donante B y una vez del donante C) después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki con la aprobación de la junta de revisión ética de la Escuela de Graduados en Medicina de la Universidad de Osaka, Japón (n.° T19204 y n.° 11122-5). Los neutrófilos se aislaron utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos humanos EasySep Direct (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá).

Los experimentos se realizaron en medio Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) con HEPES 15 mM, sin rojo de fenol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con albúmina sérica humana al 0,005 % (HSA, Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri). Para inducir NET, los neutrófilos se incubaron con PMA 100 nM o LPS 10 μg/ml de Escherichia coli O128:B12 (Sigma-Aldrich) a 37 °C durante 4 h con 5% de CO2. Tenga en cuenta que la inducción de NET inducida por LPS es muy sensible a la concentración de HSA y debe optimizarse para la cepa de LPS y el tampón de incubación46,47. Para la necrosis, los neutrófilos suspendidos se congelaron a -80 °C, luego se descongelaron a temperatura ambiente, antes de distribuirlos en alícuotas en placas o platos e incubarlos a 37 °C durante 4 h con 5% de CO2. El porcentaje de formación de NET varía de un donante a otro y entre tratamientos. Para PMA el porcentaje NETO es del 90% al 100%, mientras que para LPS es del 30% al 90%. Los espectros solo se recogieron de NET.

La microscopía de inmunofluorescencia se realizó como se describió anteriormente48. Las células se sembraron en placas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano (Thermo Fisher Scientific) a 6 x 104 células/cm2. Las células se bloquearon con HSA al 0,5 % antes de teñirlas con Hoechst 33342 4 µM (Sigma-Aldrich), Sytox Green 500 nM (Thermo Fisher Scientific) y MPO antihumana con IgG1 de ratón conjugada con PE 20 µg/ml (clon: MPO-7, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) o 20 μg/ml de control de isotipo IgG1 de ratón conjugado con PE (clon: MOPC-21, Biolegend, San Diego, CA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las imágenes se realizaron dentro de los pocillos utilizando un microscopio de fluorescencia CQ1 con objetivo de 10 × (Yokogawa, Tokio, Japón).

Las células se sembraron en placas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano a 3 x 105 células/cm2. Después del tratamiento, se eliminó el sobrenadante y se descartó de los pocillos, y las células se incubaron con 0,5 U/ml de nucleasa microcócica (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante 10 minutos a 37 °C. La digestión del ADN se detuvo mediante la adición de EDTA 5 mM con una concentración celular final de 1,4 x 106 células/ml. Las células se pipetearon vigorosamente y luego se centrifugaron durante 5 minutos a 500 xg. El sobrenadante se recogió y se congeló a -80 °C.

Para el ensayo de ADN total, las muestras de NET/ADN se tiñeron con PicoGreen y se leyó la fluorescencia en un lector de microplacas GloMax (Promega, Madison, WI). El ELISA MPO/ADN se realizó como se describió anteriormente49. Brevemente, se recubrieron placas Nunc MaxiSorp de fondo plano de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) con 5 μg/ml de MPO antihumano de IgG2b de ratón (clon: 4A4, Bio-Rad, Hercules, CA) o control de isotipo de IgG2b de ratón de 5 μg/ml. (Clon: 27–35, Biolegend) durante 1 h a temperatura ambiente. Los pasos restantes se realizaron de acuerdo con el kit ELISA de detección de muerte celular de Roche (n.º de catálogo 11544675001, Sigma-Aldrich).

Las células se sembraron en placas con fondo de cuarzo de 3,5 cm (Matsunami Glass, Osaka, Japón) a 6 x 104 células/cm2. Después del tratamiento, las células se tiñeron con Helix NP™ Blue 1 μM durante 30 minutos y se analizaron utilizando un objetivo de 60 × (NA 1,27) en una plataforma óptica personalizada que hemos descrito previamente en detalle50,51, representada en la Fig. 2. Imágenes de fluorescencia adquiridas Se utilizaron excitación con lámpara de mercurio y emisión filtrada por canal FITC para localizar NET y células necróticas. La excitación Raman se realizó con un láser de onda continua de 532 nm (1136 mW/μm2), con luz retrodispersada dirigida a un espectrómetro usando un espejo dicroico, y el espectro vibratorio (535–3075 cm-1) se midió con una cámara enfriada. (Orca 4.0, Hamamatsu, Shizuoka, Japón). El enfoque se estableció de acuerdo con la visibilidad de las características de las células, aproximadamente a 2 μm por encima del sustrato. Las células se interrogaron mediante escaneo híbrido, en el que el punto de excitación del láser se mueve rápidamente en los ejes vertical y horizontal, iluminando una región central cuadrada definida de cada célula, con la señal promedio recolectada. Se recopilaron datos de 700 a 1100 células por grupo de tratamiento, agrupados a partir de siete experimentos independientes y tres donantes diferentes.

Los datos Raman se corrigieron para los cambios espectrales del instrumento día a día utilizando un espectro de etanol estándar, la línea de base se corrigió utilizando una línea cúbica y la región silenciosa (1800–2700 cm-1) se eliminó como se describió anteriormente26. Brevemente, PCA, análisis de aprendizaje automático, trazado y cálculos estadísticos se realizaron utilizando R v3.6.152. Los datos se estandarizaron y la PCA se realizó utilizando la función prcomp y los valores F se calcularon mediante ANOVA utilizando el paquete aov. El aprendizaje automático se realizó utilizando un modelo de regresión logística penalizado con reducción de parámetros basada en lazo implementado con glmnet53, con el término de penalización optimizado mediante validación cruzada diez veces. Los gráficos de espectros y PC se crearon utilizando los paquetes ggplot254, ggbreak55 y pROC56. Los datos del ensayo de ADN total y de ELISA del complejo MPO/ADN se analizaron mediante ANOVA con pruebas de Tukey post hoc utilizando el paquete aov. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.

Los conjuntos de datos utilizados en el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue financiado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a través del Programa de Financiamiento para I+D Innovadora Líder Mundial en Ciencia y Tecnología (Programa FIRST); el Programa de Financiamiento de la Iniciativa del Centro Internacional de Investigación JSPS World Premier; la Fundación Conmemorativa Uehara; el programa Centro de Innovación (COISTREAM) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (MEXT) (a AK); JSPS KAKENHI (JP18H05282 a AK, JP18K16146 a MN, JP19K23865 a PML); la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) (20ek0109307h0003, J200705023, J200705710, J200705049, JP18cm016335 y JP18cm059042 de AK); la Federación Económica de Kansai (KANKEIREN); el Mitsubishi Zaidan1 (a AK).

Laboratorio de Biofotónica, Centro de Investigación de la Frontera de la Inmunología, Universidad de Osaka, Yamadaoka 3-1, Suita, Osaka, 565-0871, Japón

Patrick Michael Lelliott, Alison Jane Hobro, Nicholas Pavilion y Nicholas Isaac Smith

Departamento de Medicina Respiratoria e Inmunología Clínica, Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Masayuki Nishide, Yasutaka Okita, Yumiko Mizuno, Sho Obata, Shinichiro Nameki, Hanako Yoshimura y Atsushi Kumanogoh

Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Sho Obata

Laboratorio de Inmunopatología, Centro de Investigación de Inmunología Frontier, Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Atsushi Kumanogoh

Instituto de Investigación Abierta y Transdisciplinaria (OTRI), Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Atsushi Kumanogoh y Nicholas Isaac Smith

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PML, AJH, NP y NIS concibieron y diseñaron el estudio. PML llevó a cabo los experimentos. MN, YO, YM, SO, SN, HY y AK contribuyeron a la adquisición de datos. PML, AJH, NP y NIS analizaron e interpretaron los datos. PML y AJH escribieron el manuscrito. NP, MN y NIS revisaron y editaron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Patrick Michael Lelliott o Nicholas Isaac Smith.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lelliott, PM, Hobro, AJ, Pavillon, N. et al. La microscopía Raman unicelular con aprendizaje automático resalta características bioquímicas distintivas de las trampas extracelulares de neutrófilos y la necrosis. Representante científico 13, 10093 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36667-3

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Recibido: 13 de abril de 2023

Aceptado: 07 de junio de 2023

Publicado: 21 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36667-3

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