Nichos de tejido distintos dirigen la inmunopatología pulmonar a través de CCL18 y CCL21 en COVID grave

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 791 (2023) Citar este artículo

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La patología pulmonar prolongada se ha asociado con la COVID-19, pero los mecanismos celulares y moleculares detrás de esta enfermedad inflamatoria crónica no se conocen bien. En este estudio, combinamos imágenes avanzadas y transcriptómica espacial para arrojar luz sobre la respuesta inmune local en casos graves de COVID-19. Mostramos que los nichos adventiciales activados son microambientes cruciales que contribuyen a la orquestación de la inmunopatología pulmonar prolongada. La regulación positiva de las quimiocinas CCL21 y CCL18 se asocia con la transición endotelial a mesenquimatosa y la fibrosis tisular dentro de estos nichos. La sobreexpresión de CCL21 además se vincula a la acumulación local de células T que expresan el receptor afín CCR7. Estas células T tienen impreso un fenotipo agotado y forman agregados linfoides que pueden organizarse en estructuras linfoides ectópicas. Nuestro trabajo propone mecanismos de interacción inmune-estroma que promueven una respuesta inmune local autosostenida y que no se resuelve que se extiende más allá de la infección viral activa y perpetúa la remodelación del tejido.

Los nichos adventiciales se encuentran en la capa más externa de los vasos sanguíneos de tamaño intermedio a grande, así como alrededor de las vías respiratorias, y representan microambientes especializados donde las células inmunes interactúan con las células del estroma y la vasculatura, para monitorear el estado del tejido y modular las respuestas inmunes1. La COVID-19 cursa con cambios histopatológicos graves e infiltración de células inmunitarias en el pulmón. Estos ocurren como resultado directo de la infección por SARS-CoV-22, pero también indirectamente a través de una respuesta inmune desregulada3, y conducen a una ruptura funcional de las barreras vasculoepiteliales4. En fases posteriores de la enfermedad, los mecanismos de remodelación tisular destinados a reparar la estructura microanatómica del pulmón parecen comprometidos en algunos individuos y provocan cicatrización del tejido y fibrosis pulmonar5, lo que contribuye a los síntomas respiratorios crónicos y a la enfermedad fibrótica5,6. Se ha propuesto una infiltración aberrante de macrófagos, junto con un mayor número de fibroblastos en el pulmón, como característica de la enfermedad grave por COVID-197,8. Además, los macrófagos activados alternativamente que se acumulan en los pulmones de COVID-19 muestran una firma profibrótica9, aunque aún no se han aclarado los mecanismos exactos por los que promueven la fibrosis. Los cambios prolongados en el panorama inmunológico de las vías respiratorias con un mayor número de linfocitos citotóxicos y células B se han relacionado recientemente con las secuelas de la COVID-1910,11. Por lo tanto, es de suma importancia arrojar luz sobre las vías de reclutamiento que median la infiltración inmune excesiva en los pulmones y sus implicaciones para la progresión de la enfermedad. Si la patología tisular es el resultado de un reservorio viral en órganos diana, o si es causada por un mecanismo autoinmune, o si ambos fenómenos contribuyen a la enfermedad es un tema de discusión actual. Junto con la importancia de la disfunción endotelial en los patomecanismos de la enfermedad COVID-1912,13, con informes recientes que destacan las manifestaciones cardiovasculares posagudas a largo plazo14 y la enfermedad vascular pulmonar crónica6, el nicho adventicial merece especial atención para dilucidar el papel de las células inmunes. en daño tisular sostenido.

Aquí, al combinar histopatología, histología multiplex, microscopía electrónica (EM), microscopía de lámina de luz tridimensional (LSFM), secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNASeq) y transcriptómica espacial (ST), obtuvimos información sobre las interacciones entre quimiocinas y receptores de quimiocinas. que ocurre dentro de los nichos pulmonares durante el COVID-19. Proponemos una comunicación cruzada inmune-estroma desregulada que promueve una respuesta inmune local autosostenida y que no se resuelve, que se extiende más allá de la infección viral activa. Nuestro enfoque espacial único identifica la disfunción endotelial como un desencadenante de las vías de remodelación del tejido dentro de los nichos adventiciales, que aparecen como puntos de semilla para la fibrosis. Esos nichos emergen como microambientes especializados que albergan células T impresas con perfiles agotados, así como agregados de células inmunes que consisten en células B y T, en COVID-19 prolongado.

Para estudiar los cambios fisiopatológicos que se producen en el pulmón asociados a la infección por SARS-CoV-2 en nuestra cohorte, combinamos varias técnicas de microscopía y transcriptómica espacial (ST) en portaobjetos consecutivos de muestras de tejido pulmonar post mortem obtenidas de COVID-19. donantes. Se incluyeron como controles muestras de pulmón de neumonía no relacionada con COVID-19. Estratificamos los casos de COVID-19 en agudos (de 1 a 15 días de duración de la enfermedad), crónicos (más de 15 días) y prolongados (de 7 a 15 semanas) (Tabla 1). Anotamos vasos de tamaño mediano a grande, vías respiratorias, espacios alveolares, infiltrados inmunes y áreas fibróticas en secciones de pulmón teñidas con hematoxilina/eosina (HE) (Figura complementaria 1a). Estas anotaciones sirvieron como puntos de referencia para una mayor caracterización espacial de la respuesta inmune local dentro de distintos microambientes pulmonares funcionales. Los pulmones con COVID-19 mostraron alteraciones prominentes en la composición del tejido y la estructura microanatómica, caracterizadas por la acumulación de infiltrados de células inmunes y áreas fibróticas (Fig. 1a y Fig. 1a complementaria). Estos fenómenos fueron particularmente prominentes en las últimas etapas de la enfermedad, culminando en una falta de espacios alveolares. En consonancia con esto, la tinción por inmunofluorescencia (IF) de secciones de tejido adyacentes mostró una acumulación de depósitos de colágeno y de agregados de células inmunes CD45+ en fases posteriores de la enfermedad (Fig. 1b; flechas rojas). El análisis ST validó la deposición exacerbada de colágeno a nivel transcripcional (Fig. 1c), y la adquisición de grandes volúmenes de imágenes mediante microscopía de fluorescencia de lámina luminosa (LSFM) confirmó aún más el aumento en la densidad del tejido durante la enfermedad prolongada de COVID-19 (Fig. 1e, Película complementaria 1 y 2). El patrón reticular ER-TR7 formó un andamio tridimensional delicado y altamente estructurado en la fase aguda, mientras que parecía desorganizado, denso y compacto en los pulmones prolongados.

a – d Se analizaron secciones de tejido de muestras de pulmón de un donante de neumonía no relacionada con COVID y de donantes de COVID-19 en diferentes momentos después del inicio de la enfermedad utilizando técnicas de resolución espacial (n = 12 secciones de tejido). Cada columna representa una serie de secciones consecutivas del mismo donante. una tinción HE muestra la estructura del tejido en secciones enteras. Las líneas de puntos representan áreas analizadas por microscopía confocal (b) y por transcriptómica espacial (ST; c). Los cuadrados pequeños representan áreas analizadas mediante microscopía multiplex (d). b Imágenes de inmunofluorescencia (IF) correspondientes que muestran CD45 en amarillo, DAPI en magenta, Colágeno I (Col.I) en cian y Colágeno IV (Col.IV) en azul. c Expresión relativa de COL1A1, que se muestra como cambio de veces de Log2 entre el cuantil 5 y 95 y se muestra en los puntos, según lo analizado por ST. d Imágenes IF correspondientes que muestran DAPI en magenta, CD45 en amarillo y Colágeno IV en cian. e Adquisición por microscopía de fluorescencia de lámina luminosa (LSFM) de muestras de pulmón con COVID-19 agudo y prolongado teñidas con el marcador de fibroblastos ER-TR7 (amarillo) (n = 4 muestras). Consulte también las películas complementarias 1 y 2. Gráfico de puntos que representa los números absolutos de células (f) y los recuentos de células CD45+ (g) por campo de visión (FOV), que representan 665 × 665 µm, analizados mediante microscopía multiplex. Los datos (M ± SD) se analizan mediante ANOVA unidireccional con la prueba LSD de Fisher, F (3, 28) = 5,09, p = 0,006 (f) y F (3, 28) = 3,391, p = 0,03 ( gramo). Varios símbolos rellenos representan distintos donantes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. (d, f y g) (n = 32 FOV). Véanse también las figuras complementarias. 1 y 2.

Analizamos los mismos pulmones mediante cartografía de ligandos multiepítopos (MELC) 15, 16, una técnica de microscopía múltiple que nos permitió aplicar un panel de 44 parámetros para histología de inmunofluorescencia (Fig. 1d y Fig. 1b complementaria). Preprocesamos y segmentamos las imágenes de inmunofluorescencia de microscopía múltiple para obtener información cuantitativa de la composición del tejido a nivel unicelular17. El número total de células y el recuento de células CD45+ aumentaron significativamente en el grupo de COVID-19 prolongado (Fig. 1f, g). En particular, los individuos de este grupo habían resuelto la infección y las muestras de pulmón dieron negativo o solo tenían una carga de ARN muy baja mediante qPCR, dirigida al gen E del SARS-CoV-2. Para la replicación viral activa, se utilizó ARN subgenómico (sgRNA) como sustituto y obtuvimos resultados negativos para todos los tejidos pulmonares crónicos y prolongados analizados. Sin embargo, tanto los casos crónicos como los prolongados mostraron daño pulmonar agravado y puntuaciones de fibrosis histopatológica más altas según la tinción HE/Elastica van Gieson (EvG) (Tabla 1), lo que se refleja en una correlación positiva con la estratificación de la muestra. Por el contrario, la neumonía bacteriana diagnosticada y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) no se correlacionaron con la puntuación de fibrosis ni con el grupo de la enfermedad (Figura complementaria 1c), de acuerdo con una revisión reciente que informa que la enfermedad pulmonar intersticial posterior a COVID-19 se desarrolla independientemente del SDRA durante la fase aguda y puede entenderse como una nueva entidad de enfermedad fibroinflamatoria18.

Por lo tanto, estos datos muestran que la progresión grave de la enfermedad COVID-19 se caracteriza por fibrosis pulmonar y que en casos prolongados se produce una acumulación prominente de células inmunitarias, independientemente de la infección viral activa.

A continuación, nuestro objetivo fue caracterizar mejor el daño pulmonar estructural. En línea con estudios previos, observamos vasculopatía pulmonar drástica en la enfermedad COVID-19 grave4,13. En nuestras muestras, la ruptura de la barrera endotelial fue evidente por la ausencia de tinción de CD31 en 5 de 8 campos de visión (FOV) analizados en los pulmones agudos, y mostró un patrón aberrante en fases posteriores de la enfermedad (Fig. 2a). De acuerdo con informes anteriores, que apuntan a una falla en la remodelación del epitelio alveolar después de la infección por SARS-CoV-22,4, observamos una falta de la estructura prototípica de monocapa en la tinción con pancitoqueratina (PCK) (Fig. 2a). Indicativo de fibrosis pulmonar, las señales de actina del músculo liso (αSMA) y el marcador de fibroblastos reticulares ER-TR7 aumentaron con la duración de la enfermedad (Fig. 2a). Además, el análisis computacional de los datos de imágenes de microscopía multiplexadas17 (Figuras complementarias 2a-c) reveló que los números absolutos de endotelios, epitelios y fibroblastos aumentaron en las muestras prolongadas, lo que apunta a intentos de restauración, particularmente dentro del compartimento endotelial, donde el las diferencias fueron más pronunciadas (Fig. 2b).

a Imágenes de inmunofluorescencia (IF) de microscopía múltiple que representan actina del músculo liso (αSMA) en azul, CD31 en cian, pancitoqueratina (PCK) en magenta y ER-TR7 en amarillo en un campo de visión (FOV) representativo en el tejido pulmonar para cada grupo de enfermedades. . b Gráfico de puntos del número absoluto de células por FOV de células endoteliales, células epiteliales y fibroblastos en cada grupo de enfermedades. Varios símbolos rellenos representan distintos donantes. Los datos (M ± SD) se analizan mediante ANOVA de dos factores con la prueba LSD de Fisher, F (3, 84) = 8,124, p ˂ 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. (a, b) (n = 32 FOV). Véanse también las figuras complementarias. 1B y 2A-C. c Imagen ultraestructural de tejido pulmonar de autopsia de un donante agudo que muestra un vaso grande con múltiples células endoteliales desprendidas dentro de su luz (estrellas blancas). La región ampliada digitalmente del área del recuadro muestra una célula endotelial que se desprende. (n = 6 muestras de pulmón agudo). d Visualización del mapa de calor del nivel de expresión promedio de varias transcripciones relacionadas con endotelios para todas las muestras en cada grupo de enfermedades, según lo analizado mediante transcriptómica espacial (ST) (n = 12 secciones de tejido). e Corte ortogonal de una adquisición por microscopía de fluorescencia de lámina luminosa (LSFM) de una muestra de pulmón con COVID-19 agudo teñida con ER-TR7 (amarillo). La autofluorescencia tisular (magenta) permite la visualización de un vaso grande con un macrotrombo (amarillo y magenta) adherido a la pared del vaso. (n = 4 muestras). Véase también Película complementaria 3.

De acuerdo con la pérdida de CD31 en pulmones con infección aguda, observamos varios vasos con desprendimiento de células endoteliales mediante microscopía electrónica (Fig. 2c) y una regulación negativa de varias transcripciones relacionadas con el endotelio, incluido PECAM1, en el mismo grupo de enfermedad (Fig. 2d). ). La vasculopatía también se asoció con una coagulopatía prominente y eventos trombóticos (Fig. 2e, Película complementaria 3). A pesar de todos los esfuerzos, incluidos los análisis ultraestructurales (Figura complementaria 3d) e inmunohistoquímicos (Figura complementaria 3e) de acuerdo con los estándares de mejores prácticas19, no pudimos encontrar signos suficientes de infección endotelial pulmonar por SARS-CoV-2, lo que explica la extensa disfunción endotelial observada. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la alteración de la barrera endotelial, una característica destacada de la COVID-19 aguda grave, es un efecto indirecto de la infección por SARS-CoV-2, que está sujeta a restauración en fases posteriores de la enfermedad.

Para comprender los mecanismos subyacentes a los cambios funcionales dentro del compartimento estromal, epitelial y vascular, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA). Varias vías relacionadas con la activación y remodelación endotelial, junto con la transición epitelial a mesenquimatosa, la biosíntesis de colágeno y las enzimas modificadoras de colágeno, se indujeron con COVID-19 en los pulmones, particularmente en la fase prolongada (Fig. 3a). Además, la reducción de dimensionalidad y el análisis de agrupamiento no supervisado de los datos de ST revelaron 9 grupos de puntos que representaban microambientes pulmonares discretos con firmas transcripcionales distintas indicativas de endotelios (C3 y C8), epitelios (C0 y C6), estroma (C2 y C5) o distintos. linajes inmunes (C1: macrófagos y C4: células plasmáticas) (Fig. 3b). Los grupos se visualizaron en el espacio UMAP y los 25 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) principales se mostraron en un mapa de calor (Figuras complementarias 3a a c). C5 se caracterizó por transcripciones relacionadas con la contractilidad y los reordenamientos del citoesqueleto y se asignó a bronquios y puntos de referencia de vasos intermedios a grandes (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 3d), lo que sugiere identidad de miofibroblastos. El C8 endotelial se distribuyó espacialmente alrededor de esos puntos de referencia y adyacente a C5. C8 mostró una alta expresión de CCL21, una quimiocina que era apenas detectable en muestras agudas de COVID-19, pero que estaba altamente regulada en fases posteriores de la enfermedad (Figura complementaria 3e). Además, C8 se enriqueció con transcripciones relacionadas con el complemento y PTX3, que codifica la proteína 5 inducida por TNF-α (Fig. 3b y Fig. Suplementaria 3c). Esta proteína promueve la diferenciación de fibroblastos20 y participa en la activación del complemento, la angiogénesis y la remodelación tisular21. De hecho, estas regiones de estructuras contráctiles (C5) y endotelios activados (C8) se superpusieron espacialmente con áreas en las que se enriqueció la vía de remodelación de los vasos sanguíneos (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 3d). Por lo tanto, en lo sucesivo nos referiremos a ellos como nichos adventiciales activados. El grupo de macrófagos C1 no estaba restringido espacialmente a los bronquios infiltrados, sino también adyacente a estas áreas adventicias activadas (Fig. 3c y Fig. complementaria 3d). La firma transcripcional de macrófagos asociada a C1 estuvo acompañada de una alta expresión de FTL, junto con la expresión de CD163. El primero está relacionado con el almacenamiento de hierro en estado soluble, el segundo codifica el receptor eliminador de hemo (Fig. 3b) y recientemente se ha relacionado con la fibrosis pulmonar en casos graves de COVID-199. También detectamos un aumento en las células positivas para Fe3+ mediante tinción con azul de Prusia junto con la duración de la enfermedad (Tabla 1), lo que indica una fuga de plasma de los vasos rotos hacia el tejido. Además de su firma eliminadora de hemo, C1 se enriqueció en CCL18 (Fig. 3b y Fig. Suplementaria 3c), una quimiocina que se sabe que es producida por macrófagos activados alternativamente, que induce fibrosis mediante interferencia con fibroblastos en la fibrosis pulmonar idiopática (FPI)22. Los datos de secuenciación de ARN de núcleo único (snRNAseq) obtenidos de algunas de las mismas muestras y donantes (Tabla 1)23 confirmaron que los macrófagos CD163+ en COVID-19 son la fuente celular de CCL18 (Figura complementaria 3f). La población de macrófagos reguló positivamente CD163 en los pulmones con COVID-19 en comparación con los controles, y mostró un enriquecimiento de la expresión de CCL18 en fases posteriores de la enfermedad en comparación con los pulmones agudos. Al vincular CD163, CCL18 y la fibrosis tisular, C2, que mostró una clara firma fibrótica, mostró una distribución espacial similar a C1 dentro del parénquima pulmonar. Consistentemente, la vía de biosíntesis de colágeno y enzimas modificadoras se superpuso con C1 y C2, además de los nichos adventiciales activados (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 3d). Por el contrario, los epiteliales C0 y C6 mostraron un patrón de localización muy distinto. Encontramos áreas pulmonares microanatómicas enriquecidas en la vía de transición epitelial a mesenquimal (EMT), que no se superponen espacialmente con los epiteliales C0 y C6, sino con los adventiciales C5 y C8. Esto sugiere que la fibrosis tisular no sólo surge de la remodelación epitelial, sino también de los nichos adventiciales activados con una firma CCL21. Por lo tanto, es probable que también represente la transición endotelial a mesenquimatosa (EndMT). Varios genes asociados a la fibrosis, como COL1A1, COL3A1 y COL4A1, las transcripciones relacionadas con fibroblastos ACTA2, PDGFRA y CTHRC1 y el mediador profibrótico TGF-β estaban regulados positivamente en el tejido de las fases tardías de la enfermedad COVID-19 (Figura complementaria 3e). .

un diagrama de puntos que representa las puntuaciones de enriquecimiento normalizado (NES) y el porcentaje de manchas debajo del tejido que expresan vías transcripcionales relevantes para cada grupo de enfermedades, según lo analizado mediante análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de datos de transcriptómica espacial (ST). Se muestran la coagulación, la angiogénesis y la transición epitelial a mesenquimatosa (Hallmark), la activación de C3 y C5, la eliminación del hemo del plasma y la biosíntesis de colágeno y las enzimas modificadoras (Reactome) y la remodelación de los vasos sanguíneos (GOBP) (n = 12 secciones de tejido). b Gráfico de puntos que representa el NES y el porcentaje de expresión de varias transcripciones relevantes entre los 25 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) principales dentro de cada grupo ST, como se muestra en las figuras complementarias 3A a C. c Las manchas de tejido codificadas por colores de una sección de tejido ejemplar de un caso prolongado de COVID-19 analizado por ST, representan la distribución espacial de grupos de ST relevantes como se muestra en (b) y en las figuras complementarias 3a-c, y el NES de la sangre. vía de remodelación vascular (GOBP), biosíntesis de colágeno y enzimas modificadoras (Reactome) y transición epitelial a mesenquimatosa (Hallmark). Las anotaciones para los vasos medianos a grandes (amarillo) y las vías respiratorias (negro) se muestran como contornos de estos puntos de referencia tisulares. Consulte también la figura complementaria 3d. d Superposición de inmunofluorescencia (IF) de microscopía múltiple que representa αSMA (azul), CCR8 (cian), CCR7 (amarillo), ER-TR7 (magenta) y CD31 (rojo) en una muestra de pulmón COVID-19. Los canales individuales para cada tinción extracelular junto con DAPI (blanco) se muestran para una región de interés, donde la barra de escala = 40 m (n = 8 FOV). Las flechas verdes indican células CD31+SMA+ER-TR7+/- y las flechas naranjas, células CCR8+CCR7+SMA+ER-TR7+. (a – c) (n = 12 secciones de tejido).

A continuación, nos preguntamos si la vasculatura activada era realmente capaz de responder a la señal CCL18 a través del receptor afín CCR824, así como a CCL21 a través de CCR7. De hecho, detectamos una fuerte expresión de CCR8 y CCR7 en fibroblastos SMA+ y ER-TR7+ que recubren vasos grandes con endotelios alterados (Fig. 3d, flechas naranjas). Además, varias células de la pared vascular fueron positivas para marcadores tanto endoteliales como mesenquimales, CD31 y SMA y/o ER-TR7, otro signo de EndMT (Fig. 3d, flechas verdes)25,26,27. Sin embargo, si bien estas células estromales eran el subconjunto principal que expresaba CCR8 en los pulmones con COVID-19, la señal de CCR7 no se restringía al compartimento estromal. En cambio, también se observó en células con morfología hematopoyética (Fig. 3d).

En conjunto, nuestros resultados sugieren que los nichos adventiciales activados y enriquecidos con CCL21 con una firma EndMT funcionan como puntos de semilla para la fibrosis tisular, que está relacionada con la presencia de macrófagos eliminadores de hemo CCL18+.

A continuación, nuestro objetivo fue caracterizar mejor las células hematopoyéticas que expresan CCR7 dentro de los pulmones con COVID-19. Detectamos una expresión amplia de CCR7 y PD1 en grandes grupos de células T que ocurren dentro de distintos nichos adventiciales en muestras de pulmón del grupo prolongado (Fig. 4a, Fig. 4a complementaria). Algunas de estas células coexpresaron el marcador de proliferación Ki67 (Fig. 4a y Fig. 4a complementaria; flechas). Estos agregados de células T se encontraron en 7 de los 12 FOV de las muestras de pulmón prolongadas analizadas mediante microscopía múltiple. Tanto los recuentos de células T CD4+ como CD8+ se enriquecieron significativamente en los pulmones prolongados, junto con las células NK (Figuras complementarias 2a-c y 4b). La LSFM de los pulmones con COVID-19 confirmó el aumento de células T CD3+ con la duración de la enfermedad en el espacio tridimensional (Películas complementarias 4 y 5).

Una superposición de inmunofluorescencia (IF) muestra CCR7 (amarillo), CD3 (cian), αSMA (azul) y CD31 (magenta) en un pulmón prolongado con COVID-19. El cuadrado blanco representa la región de interés (ROI), donde se muestran canales individuales ampliados, junto con PD1, Ki67 y DAPI (n = 8 FOV). Véase también la figura complementaria 4a. b Representación gráfica de puntos de recuentos absolutos de células T CD4+ y CD8+ y células NK analizadas mediante microscopía múltiple. Los datos (M ± SD) se analizan mediante ANOVA de dos factores con la prueba LSD de Fisher, F (3, 84) = 29,56, p ˂ 0,0001. Consulte también las figuras complementarias 2a a c, películas complementarias 4 y 5. c Gráfico de puntos que muestra la expresión de proteínas de células T CD4+ y CD8+ en pulmones y ganglios linfáticos de donantes y controles de COVID-19. El código de color indica la intensidad de fluorescencia media (MFI) promedio para cada marcador y el tamaño del punto indica el porcentaje expresado. d Los gráficos de violín muestran el nivel de expresión de marcadores relevantes en células T CD4+ y CD8+ en los ganglios linfáticos y los pulmones para cada grupo de enfermedades. Consulte también la figura complementaria 4A – C. c – d (n = 41 FOV). e Los gráficos de violín muestran el nivel de expresión de marcadores relevantes en las células mieloides de los ganglios linfáticos para cada grupo de enfermedades. Véase también la figura complementaria 4c. (n = 9 FOV). d–e Datos analizados mediante ANOVA unidireccional con prueba de Wilcoxon, comparando cada grupo con el prolongado, donde * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001 y **** p ˂ 0.0001. f Las superposiciones IF representan DAPI (azul), HLA-DR-DQ (cian), CD3 (magenta) y CD141 (amarillo) en un ganglio linfático de control y crónico. El cuadrado blanco representa el retorno de la inversión, donde las flechas naranjas indican contactos celulares directos entre las células T y las células dendríticas CD141+HLA-DR-DQ+. Barra de escala: 20 µm (n = 9 FOV). g Visualización del mapa de calor (puntuación z) del MFI para cada marcador de células T CD4+ y CD8+ dentro de los nichos epiteliales y perivasculares pulmonares en el grupo prolongado analizado mediante microscopía múltiple. (n = 32 FOV). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Véanse también las figuras complementarias. 2a-c y 4a.

Dado que CCL21 y su receptor CCR7 apoyan la migración de células T y su localización en tejidos linfoides, pero también el reclutamiento de células T activadas en el pulmón28, nuestro objetivo fue comparar la respuesta local de las células T en el sitio efector con la de los ganglios linfáticos de drenaje emparejados ( dLN) (consulte la Tabla 1 para los órganos pareados analizados; Fig. 4c, Fig. Suplementaria 2a – c y Fig. Suplementaria 4a – c). La población de células T CD4+ de pulmones con COVID-19 mostró una mayor expresión de CD8 y marcadores relacionados con la citotoxicidad. El sello distintivo de las células T CD4+ y CD8+ en los pulmones con COVID-19 fue la expresión amplia de PD1, junto con CD16 (Fig. 4a, cy Fig. Suplementaria 4a). Mientras que el primero se considera un marcador de agotamiento prototípico, el segundo es un receptor de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Por el contrario, ambas poblaciones de células T en los dLN de COVID-19 emparejados mostraron marcadores de activación clásicos, como CD69, HLA-DR-DQ, ICOS y Ki67. El nivel de expresión de CD16 y PD1 aumentó con la duración de la enfermedad en las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ de los pulmones, de forma similar a CD57, otro marcador de agotamiento. Paralelamente, la expresión de marcadores de activación en las contrapartes de dLN también aumentó (Fig. 4d). La regulación positiva de la activación de las células T en los órganos linfoides secundarios en fases posteriores de COVID-19 reflejó el aumento en la expresión de CD141 y HLA-DR-DQ dentro de la población mieloide del dLN (Fig. 4e, f y Fig. complementaria 4c, d) . Los dLN de COVID-19 crónicos y prolongados mostraron abundantes células dendríticas (DC) CD141 + HLADR-DQ +/- dentro de las áreas de células T, donde se pudieron observar múltiples contactos directos T - DC (Fig. 4f, flechas naranjas). En particular, al igual que en los pulmones, los dLN no mostraron ningún signo de infección viral activa (Tabla 1), lo que indica que la activación persistente de las células T dentro de los dLN se produjo después de que se resolvió la infección.

Finalmente, y basándose en la aparición de agregados de células T dentro de nichos adventiciales en los pulmones prolongados con COVID-19, comparamos el perfil de expresión de las células T en distintos nichos pulmonares dentro de esas muestras (Fig. 4g). Observamos la mayor expresión de CD16, PD1 y el marcador de proliferación Ki67 en la población de células T CD4+ ubicadas dentro del nicho adventicial, en comparación con sus contrapartes del nicho epitelial. La coexpresión de estos marcadores se confirmó a nivel unicelular dentro de esas áreas, junto con la expresión variable de activación y/o marcadores funcionales (Figura complementaria 4a). Recientemente se han descrito características similares para poblaciones precursoras de células T agotadas (TPEX) en el contexto de infecciones virales crónicas, donde están destinadas a equilibrar la eliminación viral y la inmunopatología29,30.

Por lo tanto, mientras que la activación de las células T persiste en los ganglios linfáticos de drenaje, los nichos adventiciales pulmonares enriquecidos con CCL21 en los agregados prolongados de células T del huésped COVID-19 con un fenotipo agotado, lo que sugiere una impronta local de la respuesta inmune.

Algunos de los grandes agregados de células inmunes observados en las muestras prolongadas de pulmón parecían particularmente densos, estaban asociados a estructuras de colágeno+ en el espacio adventicial y, a veces, estaban directamente unidos a los bronquios (Fig. 5a y Fig. Suplementaria 5b). El análisis ST reveló una huella transcripcional única dentro del área donde se ubicaban las células CD45+ (Fig. 5a, b). De acuerdo con nuestros resultados de microscopía múltiplex, las transcripciones relacionadas con TPEX, como CD3D, TCF7 y SELL, se acumularon dentro de esa área. CCL19, CCL21, LTB y CXCL13, que son citocinas que desempeñan un papel crucial en la organización de las estructuras linfoides31, se localizan allí. En esa línea, allí se acumuló fuertemente el regulador maestro de células B PAX5, junto con CCR6, que se ha relacionado con la activación de las células B y la formación de memoria32,33. Por otro lado, las transcripciones de inmunoglobulinas IGHG1, IGHD, IGHA1 e IGHM se expresaron de manera prominente en las regiones que rodean las vías respiratorias y se encontraron niveles más bajos de IGHD, IGHA1 e IGHM dentro del agregado linfoide (Figura complementaria 5a). Si bien IGHA1 se detectó de manera sólida en todas las muestras de pulmón analizadas, las transcripciones de IGHA2 estuvieron en su mayoría ausentes, de acuerdo con los datos publicados de sangre34 y pulmón35. Las transcripciones de HLA-DRA y MKI67 se expresaron de manera más amplia en la sección de tejido, pero también se enriquecieron dentro de esa región, lo que indica la aparición de presentación y proliferación de antígenos (Figura complementaria 5a). Es de destacar que las transcripciones relacionadas con macrófagos, como MARCO e IL1B, no se expresaron dentro del área enriquecida con linfocitos, sino dentro de las estructuras de las vías respiratorias (Figura complementaria 5a). Se pudieron observar agregados de células inmunes grandes, densos y estructurados similares, que muestran la misma huella transcripcional única que recuerda a las estructuras linfoides ectópicas, en 2 de cada 3 pulmones prolongados analizados por ST (Figuras complementarias 5b, c). Además de eso, en otro caso prolongado se encontraron agregados linfoides más pequeños que contienen células B Pax5 + y células T CD4 +, en asociación con vénulas endoteliales altas de PNAd + (Fig. 5c). Consistentemente, también observamos un aumento significativo en el número absoluto de células B y células plasmáticas en el grupo de COVID-19 prolongado, en comparación con los tejidos de control y con las etapas anteriores de la enfermedad (Fig. 5d). La aparición de grandes agregados linfoides se correlacionó con la estratificación de los donantes y con la puntuación de fibrosis, pero no con otras características clínicas, lo que vincula su aparición con la progresión de la enfermedad y con los nichos adventiciales activados (Fig. 5e).

una imagen de inmunofluorescencia (IF) que muestra CD45 (amarillo), DAPI (magenta), colágeno IV (cian) y colágeno I (azul). El cuadrado blanco representa una región de interés (ROI), que se muestra ampliada y representa un bronquio altamente infiltrado con un denso agregado de células inmunes adyacente a él en la esquina inferior izquierda. b La distribución espacial de las transcripciones relacionadas con la estructura linfoide ectópica se muestra codificada por colores como puntuaciones de enriquecimiento normalizadas (NES) superpuestas con puntos de referencia tisulares relevantes: vasos medianos a grandes (línea amarilla), estructuras de las vías respiratorias (línea negra). y estructura linfoide (línea naranja). a, b (n = 2 muestras de pulmón prolongadas). Consulte también la Fig. 5 complementaria. c Imágenes IF de la misma área de un pulmón prolongado, donde DAPI (azul), CD3 (rojo), PNAd (verde) y Colágeno IV (Col. IV, blanco) se muestran en el panel izquierdo , mientras que DAPI (azul), Pax5 (magenta) y CD4 (cian) se muestran a la derecha (n = 9 FOV). d Representación gráfica de puntos de los recuentos absolutos de células B/células plasmáticas por campo de visión analizado mediante microscopía múltiplex. Los datos (M ± SD) se analizan mediante ANOVA unidireccional con la prueba LSD de Fisher, F (3, 28) = 8,332, p = 0,0004 (n = 32 FOV). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Consulte también las figuras complementarias 2a-c. e Visualización del mapa de calor de la correlación entre los parámetros clínicos relevantes, la estratificación de los donantes y la puntuación de fibrosis con la presencia de grandes agregados inmunes. Consulte también la figura complementaria 1c. Los valores de Pearson r se muestran en el gráfico con un código de color adicional para correlaciones positivas (azul) o negativas (rojas). La significancia estadística (bilateral) se representa con * para p = 0,039 y ** para p = 0,007.

En conjunto, nuestros datos sugieren que los nichos adventiciales activados son microambientes especializados que apoyan la formación de estructuras linfoides ectópicas en pulmones prolongados con COVID-19.

Los mecanismos patogénicos detrás de la COVID-19 prolongada no se comprenden bien, aunque las consecuencias están desafiando a muchas personas. En este estudio, estratificamos las muestras según la duración de la enfermedad e incluimos un grupo prolongado (7 a 15 semanas de duración de la enfermedad después de la infección), en el que no se pudo informar una infección viral activa en los pulmones ni en los LN. Sin embargo, esos individuos mostraron un daño pulmonar agravado junto con un aumento en la infiltración de linfocitos.

Al combinar enfoques de microscopía avanzada junto con análisis computacional unicelular con técnicas de ST en tejidos de autopsia, delineamos el nicho adventicial como un sitio donde una respuesta inmune desregulada conduce a la remodelación del tejido en COVID-19 prolongado. De acuerdo con la idea de que la disfunción endotelial es un mecanismo patológico clave en COVID-1912,13 y que las células endoteliales son participantes importantes y reguladoras de las reacciones inflamatorias36, proponemos la transición endotelial a mesenquimatosa (EndMT) como un mecanismo que impulsa la fibrosis. Cuando las células endoteliales activadas se someten a EndMT, se reprograman transcripcionalmente, sus uniones celulares estrechas se alteran y se convierten en células similares a fibroblastos. En consecuencia, pierden la expresión de proteínas de adhesión celular, como CD31, mientras que los factores específicos del mesénquima, incluida la α-SMA, están regulados positivamente37. Todas estas características son evidentes en nuestras muestras (Figs. 2a, cyd, 3c, d, Figs. complementarias 3c, dy 4a). Además, encontramos que los fibroblastos en los nichos adventiciales del pulmón COVID-19 expresan el receptor de quimiocina CCR8 (Fig. 3d). Su ligando, CCL18, se ha relacionado previamente con la inflamación pulmonar y la fibrosis38 y es el biomarcador asociado más consistentemente con resultados negativos en la FPI39. Anteriormente se informó que CCL18 estaba enriquecido en células mieloides ARN+ del SARS-CoV-2 en los pulmones de personas fallecidas por COVID-192. Recientemente hemos demostrado que los macrófagos profibróticos alternativamente activados se acumulan en los pulmones fibróticos de COVID-199. En este estudio, demostramos que los macrófagos CD163 + que se acumulan en los pulmones de COVID-19 producen CCL18 y asignan espacialmente esta quimiocina a los parches fibróticos (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 3d). Además de la conocida función profibrótica de CCL18, recientemente se ha demostrado que esta quimiocina actúa como un factor intrínseco a las células que promueve la longevidad de los macrófagos residentes en los tejidos en la inflamación crónica40. La biomecánica tisular alterada inducida por la fibrosis puede tener un impacto adicional en la ubicación y función de las células inmunes en esos sitios41.

Nuestros resultados también demuestran un enriquecimiento en CCL21 en COVID-19 prolongado (Figura complementaria 3f), estando restringido espacialmente a espacios adventiciales activados con EndMT en curso (Figura 3c). Se descubrió que los niveles altos de CCL21 estaban asociados con una insuficiencia pulmonar persistente durante al menos 3 meses después del ingreso hospitalario con COVID-1942. CCR7, el receptor para CCL21, se expresa en fibroblastos de FPI a diferencia de los fibroblastos de pulmón normales, y los fibroblastos derivados de CCR7+ de FPI responden a CCL21 con activación, migración, supervivencia y proliferación43,44. Aquí mostramos que los miofibroblastos en los pulmones con COVID-19 también expresan CCR7 (Fig. 3d) y, por lo tanto, pueden responder a las señales elevadas de CCL21 dentro de los nichos adventiciales, particularmente en la fase prolongada de la enfermedad. Por otro lado, CCL21 es bien conocido por su papel en el reclutamiento de células T CCR7+ en órganos linfoides secundarios para organizar la respuesta inmune adaptativa45,46. La expresión de CCL21 también es esencial para el reclutamiento de células T efectoras en los pulmones28. En línea con eso, nuestros resultados muestran una amplia expresión de CCR7 dentro de la población de células T en los pulmones de COVID-19 prolongado, el momento en el que los números absolutos de células T CD4+ y CD8+ aumentan significativamente en comparación con todos los demás grupos de enfermedades analizados ( Figuras 4a, b). Además, la marcada regulación positiva de CD16 en las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ de pulmón y el enriquecimiento de las células T citotóxicas CD4+ de pulmón (Fig. 4c y Fig. 4a complementaria) sugiere que las células T adquieren citotoxicidad dependiente de anticuerpos dentro del tejido pulmonar. en línea con los informes publicados47.

Al comparar el fenotipo de células T del pulmón con el de los dLN emparejados, nuestros datos apuntan a un cambio hacia el agotamiento dentro del sitio inflamatorio, en contraposición a un estado activado más convencional en los órganos linfoides secundarios (Fig. 4c, d y Suplementario). Figuras 4a-c). De acuerdo con el perfil de activación persistente de las células T, también informamos un aumento en CD141 + HLA-DR-DQ +/- DC en los LN con progresión de la enfermedad, mientras que estas células son indetectables en el pulmón (Fig. 4e, f y Fig. Suplementaria). .2a,c). Las DC CD141+ representan un subconjunto único de DC mieloides que presenta Ag viral de forma cruzada después de la absorción de células infectadas por virus necróticos48. La falta de evidencia de persistencia viral tanto en los pulmones como en los dLN del grupo prolongado sugiere que la presentación cruzada continua de antígenos celulares necróticos en órganos linfoides secundarios causa la activación persistente de las células T. Por otro lado, el agotamiento mostrado por el conjunto de células T pulmonares se caracteriza por una regulación positiva amplia y robusta de PD1 en los compartimentos de células T CD4+ y CD8+, junto con un aumento en CD57 (Fig. 4a, c, d y Fig. Suplementaria). .4a). Estas moléculas inmunomoduladoras también se expresan en células en proliferación, como lo muestra la positividad de Ki67 (Fig. 4a y Fig. 4a complementaria). Trabajos recientes han identificado un vínculo entre el agotamiento y el mantenimiento a largo plazo de las células T30, con un papel importante de la señalización del TGF-β en la promoción de la generación de TPEX, una población precursora de células T agotadas. Esas células se caracterizan por una función efectora restringida y un perfil metabólico que respalda su persistencia49. De hecho, informamos un aumento de TGF-β en los pulmones de los grupos crónicos y prolongados de COVID-19 (Figura complementaria 3f), y estudios previos han destacado el papel esencial del TGF-β que afecta las funciones inmunes desreguladas en COVID-1935,50 . Además, recientemente se ha demostrado que CCR7 marca una población de TPEX similar a un tallo localizada en un entorno estromal rico en CCL2129. El hecho de que CCL21 esté altamente enriquecido en regiones de acumulación de células T a largo plazo en los pulmones respalda aún más la idea de que esas áreas representan nichos de TPEX. Por lo tanto, nuestros hallazgos extienden el concepto de nichos TPEX al tejido humano crónicamente inflamado y asignan los nichos a espacios adventiciales.

En casos prolongados, algunas de las áreas enriquecidas en los ligandos CCR7 CCL19 y CCL21 mostraron la presencia de transcripciones de LTB (Fig. 5b). Se ha demostrado que la linfotoxina beta (LT-β) mejora aún más la expresión de CCL21 tras la exposición a las vías respiratorias, lo que puede representar un circuito de retroalimentación positiva para mantener las células T CCR7+28 en esas áreas. La expresión de la quimiocina CXCL1351 que atrae células B aumenta en las mismas áreas pulmonares (Fig. 5b) y se co-localiza con PAX5, junto con evidencia de un perfil de células B de la mucosa, activación local de células B y presentación de antígeno. En conjunto, los datos presentados aquí sugieren la formación de estructuras linfoides ectópicas en pulmones prolongados con COVID-19 y vinculan espacialmente estas estructuras con nichos adventiciales activados que contienen TPEX y que muestran signos de patología pulmonar. Si existe también un vínculo funcional entre el agotamiento de las células T y la formación de estructuras linfoides ectópicas será un tema de investigación futura.

A pesar de las limitaciones no despreciables de los estudios post mortem, nuestros resultados sugieren que la inmunopatología pulmonar en el COVID-19 prolongado puede ocurrir dentro de nichos adventiciales activados, independientemente de la infección viral activa. Los mecanismos identificados aquí probablemente no sean exclusivos de la COVID-19 y podrían aplicarse, al menos hasta cierto punto, a otras enfermedades crónicas, por ejemplo, las enfermedades autoinmunes. Somos conscientes de que se pueden derivar otras conclusiones mecanicistas de estos datos, que representan hipótesis adicionales y alternativas. Sin embargo, nuestro trabajo vincula espacialmente la fibrosis tisular, el agotamiento de las células T y la organización de estructuras linfoides ectópicas, que representan características distintivas de las enfermedades inflamatorias crónicas y el cáncer. Nos resulta atractivo explorar más a fondo el alcance de las características compartidas entre esas diversas condiciones a nivel espacial, para evaluar si esos mecanismos pueden abrir nuevos caminos para estrategias terapéuticas, más allá de COVID-19.

Las muestras de pulmón y ganglios linfáticos de drenaje pulmonar (dLN) incluidas en este estudio se recolectaron en el Departamento de Patología de Charité - Universitätsmedizin Berlin como parte del Biobanco de autopsias de COVID-19 (consulte también la Tabla complementaria 1). Este estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki y con la aprobación del Comité de Ética de la Charité (EA 1/144/927 13, EA2/066/20 y EA1/317/20) y la Charité - BIH COVID- 19 junta de investigación. Las autopsias se realizaron sobre la base legal del artículo 1 926 SRegG BE de la Ley de autopsias de Berlín y del artículo 25, apartado 4 de la Ley alemana de protección de infecciones. Se obtuvo el consentimiento de la autopsia de las familias de los pacientes. Las identidades de los donantes se codificaron en el hospital antes de compartirlas para el procesamiento de muestras o el análisis de datos. Algunos de los donantes forman parte de las cohortes publicadas previamente en9,19,52 y53. Todos los donantes de COVID-19 mostraron un resultado positivo en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real en hisopos orofaríngeos en el momento del ingreso hospitalario. Todas las características relevantes y la información clínica de los donantes se presentan en la Tabla 1.

Para la evaluación del ARN del SARS-CoV-2 de pulmón y muestras de dLN, se utilizaron muestras de tejido no fijadas y, cuando fue posible, no crioconservadas (es decir, nativas). El ARN se purificó a partir de aproximadamente 50 mg de tejido homogeneizado obtenido de todas las muestras utilizando el sistema MagNAPure 96 y el kit MagNAPure 96 DNA and Viral NA Large Volume (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los controles sin COVID-19 fueron validados mediante la prueba rápida Rhonda PCR COVID-19 (Spindiag) de acuerdo con el protocolo del fabricante en aproximadamente 50 mg de tejido homogeneizado junto con un control positivo.

Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real para el SARS-CoV-2 en extractos de ARN con RT-qPCR dirigida al gen E del SARS-CoV-2. La cuantificación del ARN viral se realizó utilizando transcripciones de ARN in vitro cuantificadas fotométricamente54. El ADN total se midió en todos los extractos utilizando el kit Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific). El análisis RT-qPCR se replicó al menos una vez para cada muestra.

Como correlato de la replicación activa del virus en los tejidos analizados, se evaluó el ARN subgenómico (ARNsg) mediante el uso de oligonucleótidos dirigidos a la secuencia reguladora transcripcional líder y una región dentro del ARNsg que codifica el gen E del SARS-CoV-255. Toda la información se presenta en la Tabla 1.

Se tomaron bloques de tejido FFPE de pulmón el día de la autopsia y se fijaron durante 24 h en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente. La tinción histológica de rutina (HE, EvG y azul de Prusia) se realizó según procedimientos estándar.

La inmunohistoquímica para la tinción de la nucleocápside se realizó 1:4000 con #HS-452 011 (ratón; sistemas Synaptic) en un tinte automático Benchmark XT (Ventana Medical Systems) con métodos estándar de recuperación de antígenos (tampón CC1, pH 8,0, Ventana Medical Systems) usando 4- Secciones de tejido FFPE de μm de espesor. Las secciones de inmunohistoquímica fueron evaluadas por al menos dos (neuro) patólogos certificados de común acuerdo. Para validar biológicamente las tinciones inmunohistológicas, se utilizaron tejidos de control que albergaban o carecían del antígeno esperado. Los patrones de tinción se compararon con los resultados esperados como se especifica en la Fig. 2B complementaria, se aplicó una puntuación semicuantitativa (0 = sin células positivas, + = células positivas únicas, ++ = algunas células positivas, +++abundantes células positivas y escombros) (consulte la Tabla 1 y la Figura complementaria 2B).

Dos patólogos independientes calificaron las células positivas para Fe3+ mediante tinción con azul de Prusia de forma semicuantitativa (0 = sin células positivas; + = células individuales; ++ = algunas células y deposiciones de hierro; +++ = abundantes células positivas y deposiciones de hierro).

Las imágenes se analizaron utilizando un microscopio Zeiss Axiolab 5.

Las muestras de pulmón de autopsia congeladas se descongelaron, se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % y formaldehído al 2 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se incluyeron en Epon de acuerdo con un protocolo de rutina que incluía tinción en bloque con acetato de uranilo y ácido tánico52. La digitalización a gran escala de secciones ultrafinas (70 nm) se realizó utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Zeiss Gemini 300 junto con un detector STEM a través del software Atlas 5 con un tamaño de píxel de 3 a 4 nm como se describió anteriormente56. Las regiones de interés de los conjuntos de datos a gran escala se guardaron mediante anotaciones ("mapeadas") y luego se registraron a muy alta resolución utilizando un tamaño de píxel de 0,5 a 1 nm. Anteriormente se publicaron otras imágenes de partículas virales en tejido pulmonar de autopsia del mismo paciente57,58,59. Intentamos optimizar el manejo de la muestra para una mejor conservación del tejido; sin embargo, no se pueden excluir los efectos mediados por la autólisis y las condiciones de fijación subóptimas. También analizamos dos conjuntos de datos a gran escala de autopsias pulmonares que publicamos anteriormente52 (ver también http://www.nanotomy.org/OA/Krasemann2022eBioMedicine/index.html).

Se cortaron criosecciones de tejido pulmonar a 7 µm en un microtomo MH560, se transfirieron a portaobjetos Superfrost Plus Gold (Fisher Scientific, Jena, Alemania) y se secaron al aire. Las secciones se rodearon con una pluma PAP (Zymed Laboratories, Jena, Alemania) y se rehidrataron con PBS durante 10 minutos. Después de eso, las secciones se bloquearon durante 20 minutos a temperatura ambiente con suero de cabra al 10% en PBS. Para la tinción por inmunofluorescencia, los anticuerpos se diluyeron en tampón de tinción (PBS, BSA al 5% y Triton al 0,01%) y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos. Para la tinción se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-Colágeno I-PE, anti-Colágeno IV-FITC, anti-CD45-Alexa Fluor 647 y DAPI. Después de la tinción, las muestras se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos y se montaron con medio de montaje ProLong Gold (Life Technologies, Waltham, MA). Las imágenes se adquirieron mediante microscopía confocal utilizando un microscopio Zeiss LSM 880 con objetivo × 20/0,5 NA (aire) a temperatura ambiente.

Se cortó tejido fresco congelado de pulmón y dLN en secciones de 5 µm con un criotomo MH560 (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) en portaobjetos (24 × 60 mm; Menzel-Gläser, Braunschweig, Alemania) que habían sido recubiertos con 3-aminopropiltrietoxisilano. (SIMIOS). Las muestras se fijaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) con paraformaldehído al 2% recién abierto, grado de microscopía electrónica (sin metanol ni ARNasa; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Filadelfia, EE. UU.). Después del lavado, las muestras se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y la unión inespecífica se bloqueó con suero de cabra al 10% y BSA al 1% en PBS durante al menos 20 minutos. Posteriormente, se creó una cámara de fluido que contenía 100 µl de PBS utilizando láminas de silicona “prensar para sellar” (Life technologies, Carlsbad, California, EE. UU.; 1,0 mm de espesor) con un corte circular (10 mm de diámetro), que se adjunto al cubreobjetos que rodea la muestra. Antes de cada experimento MELC, se preparó una solución de lavado nueva consistente en PBS con MACS BSA al 5% (Miltenyi Biotec) y Triton X-100 al 0,02%. La muestra se colocó en el soporte de muestra y se fijó con cinta adhesiva, seguido del posicionamiento preciso de la lente de agrupación, el camino de la luz y la iluminación Köhler del microscopio.

La adquisición de imágenes MELC se realizó como se mostró anteriormente16,17. En resumen, generamos los datos histológicos multiplexados en un Toponome Image Cycler® MM3.2 (TIC) modificado originalmente producido por MelTec GmbH & Co.KG Magdeburg, Alemania15. ImageCycler es un sistema microscópico robótico con 3 componentes principales:(1) un microscopio de (epi)fluorescencia de campo amplio invertido Leica DM IRE2 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania), equipado con una cámara Hamamatsu CMOS ORCA Flash 4.0 LT (Hamamatsu Photonics KK , Ciudad de Hamamatsu, Japón) y una etapa XY controlada por motor, (2) un sistema de pipeteo que consta de un robot XYZW (Cybertron GmbH, Berlín, Alemania) y una pipeta/diluidor CAVRO XL3000 (Tecan GmbH, Crailsheim, Alemania) y (3) un software TIC-Control (MelTec) v3.0 para controlar el microscopio y el sistema de pipeteo y para la adquisición de imágenes sincronizadas.

Cada experimento MELC es una secuencia de ciclos iterativos, cada uno de los cuales consta de cuatro pasos: (i) pipeteo del anticuerpo acoplado a fluorescencia sobre la muestra, incubación y lavado posterior; (ii) enfoque automático de correlación cruzada basado en imágenes de contraste de fase, seguido de la adquisición de la pila tridimensional de imágenes de fluorescencia (+/− 5 pasos z); (iii) fotoblanqueo del fluoróforo; y (iv) un segundo paso de enfoque automático seguido de la adquisición de una pila 3D de imágenes de fluorescencia post-blanqueo (+/- 5 pasos z). En cada ciclo de cuatro pasos se utilizaron hasta cuatro anticuerpos marcados con fluorescencia, combinando PE, FITC, APC y DAPI, y se adquirieron imágenes para dos campos de visión (FOV) para maximizar el área y el número de células analizadas para cada experimento y muestra. .

Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 1. Los anticuerpos se tiñeron en el orden indicado.

El preprocesamiento de imágenes se realizó como se describió anteriormente17. En resumen, la imagen de contraste de fase de referencia tomada al comienzo de la medición se utilizó para alinear todas las imágenes mediante correlación cruzada. Posteriormente, la señal de la imagen de blanqueamiento en cada ciclo y plano focal se utilizó para restar el fondo y corregir la iluminación de la imagen de fluorescencia obtenida en el mismo ciclo y plano focal15. De esta manera, la autofluorescencia tisular y la potencial señal residual de la imagen de blanqueamiento anterior ciclo fueron eliminados. En el caso de anticuerpos desacoplados y para tener en cuenta la señal inespecífica del anticuerpo secundario utilizado, restamos la imagen de fluorescencia del anticuerpo secundario teñida y adquirida antes del anticuerpo primario correspondiente, en lugar de la imagen de blanqueo. Luego, se aplicó un algoritmo de "profundidad de campo extendida" en la pila de fluorescencia 3D en cada ciclo60. Luego se normalizaron las imágenes en Fiji, donde se utilizó un algoritmo de bola rodante para la estimación del fondo, se eliminaron los bordes (teniendo en cuenta el desplazamiento máximo permitido durante el procedimiento de enfoque automático) y las intensidades de fluorescencia se escalaron al rango de intensidad completo (16 bits = > 216). . Las imágenes de fluorescencia 2-D generadas se segmentaron y analizaron posteriormente.

La segmentación se realizó en un proceso de dos pasos como se describió anteriormente17, un paso de clasificación de señales usando Ilastik 1.3.261 y un paso de reconocimiento de objetos usando CellProfiler 3.1.862. Se utilizó Ilastik para clasificar los píxeles en tres clases: núcleos, membranas y matriz extracelular (ECM). Se generó un mapa de probabilidad para cada clase. La clasificación de imágenes con respecto a membranas y ECM se realizó sumando una combinación de imágenes, utilizando marcadores expresados ​​en los respectivos compartimentos, mientras que solo se utilizó la señal DAPI para clasificar los núcleos. El algoritmo de bosque aleatorio (aprendizaje automático, Ilastik) se entrenó mediante clasificación manual de píxeles en una pequeña región de un conjunto de datos (aproximadamente el 6 % de la imagen) y se aplicó al resto sin volver a entrenar. Posteriormente se utilizó CellProfiler para segmentar los mapas de probabilidad de núcleos y membranas y para generar núcleos y máscaras binarias celulares, respectivamente. Estas máscaras se superpusieron a las imágenes de fluorescencia individuales adquiridas para cada marcador, con el fin de extraer información unicelular (intensidad media de fluorescencia, MFI) de cada marcador por célula segmentada y sus coordenadas espaciales.

Los datos se transformaron utilizando la función arcoseno hiperbólico con un argumento de escala de 0,2.

Después de la exclusión de las células que no expresan ninguno de los marcadores incluidos en el panel MELC estableciendo un límite en MFI = 0,15, se analizó la expresión de proteínas de 39,074 células individuales de 14 muestras de pulmón y 32,258 células individuales de 7 muestras de dLN de pulmón emparejadas. El paquete Seurat 4.0.0 se utilizó en R (R Core Team (2021, 2021) (https://www.R-project.org/)63 para realizar el centrado y escalado medio, seguido del análisis de componentes principales (PCA) y redujo las dimensiones de los datos a los 11 componentes principales superiores en el pulmón y 10 componentes principales en los dLN pulmonares. Se inicializó la aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) en este espacio PCA para visualizar los datos en dimensiones reducidas de UMAP. agrupados en el espacio PCA utilizando el algoritmo Shared Nearest Neighbor (SNN) implementado como FindNeighbors y FindClusters con n.epochs = 500 y parámetros predeterminados (res = 0,8) para el conjunto de datos pulmonares. Obtuvimos 26 grupos que fusionamos para obtener poblaciones relevantes para nuestro análisis se basó en marcadores de linaje canónico. Terminamos con 8 grupos de células que se anotaron manualmente en función de los marcadores específicos del tipo de célula que se expresaron diferencialmente. La expresión de proteínas de los grupos de células principales se visualizó utilizando las funciones UMMAPPlot, DotPlot y VlnPlot de Seurat. Se obtuvieron y visualizaron 7 grupos de células en el conjunto de datos de dLN de pulmón utilizando los mismos algoritmos y funciones, pero con res = 0,2.

Comparamos el fenotipo de los grupos de células T CD4+ y CD8+ ubicados en el nicho perivascular con los ubicados en el nicho epitelial. Definimos el nicho como el área de un radio de 32 píxeles (equivalente a 10 µm; el tamaño promedio de una célula hematopoyética) alrededor de cada célula endotelial o epitelial, similar al análisis anterior17. Extrajimos el MFI de cada marcador relacionado con células T para la suma de todos los nichos perivasculares y nichos epiteliales y mostramos el perfil de expresión como un mapa de calor que muestra los valores de puntuación z.

La visualización de la expresión génica en el tejido pulmonar se realizó utilizando el kit de expresión génica espacial Visium 10 × (10 × Genomics) siguiendo el protocolo del fabricante. Las cuatro áreas de captura en un portaobjetos de expresión genética Visium de Genomics 10x constan de 5000 puntos con oligos de ADN para la captura de ARNm que tienen un código de barras espacial único y un identificador molecular único (UMI). Cada punto tiene 55 µm de diámetro y, por lo tanto, puede capturar ARNm de 1 a 10 células. ST analizó secciones de tejido de las mismas muestras de pulmón humano fresco congelado utilizadas para MELC y snRNA-seq. Brevemente, las muestras de pulmón de control (n = 3) y de COVID-19 (n = 9) de donantes categorizados según la duración de la enfermedad (n = 3 aguda, n = 3 crónica, n = 3 prolongada) se cortaron en secciones de 10 μm utilizando un Criotomo MH560 (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y montado en portaobjetos Visium 10X, que se enfriaron previamente a -20 °C. Las secciones se fijaron en metanol previamente enfriado durante 30 minutos, se tiñeron con CD45-AF647, CD31-AF594 y DAPI durante 30 minutos y se tomaron imágenes usando un microscopio confocal LSM 880 (Zeiss). Luego, las secciones se permeabilizaron durante 10 minutos y se construyeron bibliotecas de ADNc marcadas espacialmente utilizando el kit 10x Genomics Visium Spatial Gene Expression 3' Library Construction V1. Las bibliotecas de ADNc se secuenciaron en un Illumina NextSeq 500/550 utilizando kits de alto rendimiento de 150 ciclos con una profundidad de secuenciación de ~5000 lecturas por punto. Los marcos alrededor del área de captura en el portaobjetos de Visium se alinearon manualmente y los puntos que cubrían el tejido se seleccionaron manualmente en función de la tinción de inmunofluorescencia, utilizando el software Loupe Browser 5.1.0 (10 × Genomics). Los datos de secuenciación se asignaron al transcriptoma de referencia GRCH38-2020-A utilizando el software Space Ranger (versión 1.3.0, 10 × genómica) para derivar una matriz de expresión de código de barras puntual de características.

Las salidas de Space Ranger (matrices de códigos de barras y datos de imágenes) de 31.801 puntos espaciales con códigos de barras de doce áreas de captura de Visium 10x se filtraron e integraron en R (versión 4.1.0) con Seurat (versión 4.0.4). De cada biblioteca se combinaron manchas con al menos 250 genes detectados y menos del 13% de contenido mitocondrial. Para ello, se realizó la normalización SCTransform64, con el fin de armonizar los residuos de Pearson de cada conjunto de datos de RNAseq. Seleccionamos nfeatures = 3000 para la integración posterior. Luego, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en la matriz compuesta por manchas y recuentos de expresión génica (UMI). De este modo, las dimensiones de los datos se redujeron a los 50 componentes principales principales. La aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) se inicializó en este espacio PCA para visualizar los datos en dimensiones UMAP reducidas.

Los puntos se agruparon en el espacio PCA utilizando el algoritmo Shared Nearest Neighbor (SNN) implementado como FindNeighbors y FindClusters con parámetros k = 30 y res = 0,3. El método arrojó 12 grupos de manchas, uno de los cuales estaba enriquecido principalmente con genes mitocondriales. Eliminamos este grupo del conjunto de datos y realizamos nuevamente PCA con los 50 componentes principales principales, FindNeighbors y FindClusters con parámetros k = 30 y res = 0,3. El método arrojó nueve grupos de puntos que representaban áreas microanatómicas de pulmón con firmas transcripcionales distintas y que luego se visualizaron en el espacio UMAP.

Los datos integrados también se utilizaron para realizar un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) con el paquete fgsea (versión 1.18.0)65, que comparó los genes clasificados por Wilcoxon de cada conjunto de datos con los conjuntos de genes Hallmark, Reactome y Gene Ontology de MSigDB. (v7.4). Sólo se tuvieron en cuenta los genes significativamente enriquecidos (p ajustado <0,05) para medir la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES). Luego realizamos un análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) con el paquete de escape (versión 1.2.0)66, donde las puntuaciones de enriquecimiento normalizadas se pueden visualizar en el gráfico de características espaciales en Seurat. El alcance de NES se recortó al primer y último percentil cinco para mejorar la visibilidad.

Cada muestra de tejido pulmonar se picó y se colocó en medio de digestión (500 U/ml de colagenasa, 1,5 U/ml de dispasa y 1 U/ml de ADNasa) durante 1 h a 37 °C. Las células se filtraron a través de un colador de 70 µm y la reacción enzimática se detuvo mediante RPMI frío con suero bovino fetal al 10 % y L-glutamina al 1 %. Las células se lavaron con 50 ml de RPMI frío con suero bovino fetal al 10 % y L-glutamina al 1 % y los glóbulos rojos se lisaron usando una solución de lisis de glóbulos rojos (MiltenyiBiotec). Finalmente, las células se filtraron utilizando un filtro celular FlowmiR de 40 μm (Millipore) y se resuspendieron en PBS suplementado con suero bovino fetal al 2% a una concentración de 10.000 células/μl para scRNA-Seq. La captura de células individuales y las construcciones de bibliotecas posteriores se realizaron utilizando el kit de preparación de bibliotecas Chromium Single Cell 3ʹ V3.1 de acuerdo con el protocolo del fabricante (10x Genomics). Se amplificaron por PCR el ADNc completo junto con los identificadores de códigos de barras celulares y se prepararon bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas construidas se secuenciaron en Nextseq 500 usando 28 ciclos para lectura, 1,55 ciclos para lectura 2 y 8 ciclos de índice, o en Novaseq 6000 S1 usando 28 ciclos para lectura 1, 64 ciclos para lectura 2 y 8 ciclos de índice. a una profundidad media de 36000 lecturas por celda.

Se utilizó el paquete de software Cell Ranger (Versión 3.1.0) para procesar datos de secuenciación sin procesar con la referencia GRCh38. El análisis de datos de secuenciación de ARN unicelular se realizó en R (versión 3.6.1) con Seurat (versión 3.1.1). Se combinaron de cada biblioteca células con al menos 500 y menos de 5000 genes detectados y menos del 10% de contenido mitocondrial. La profundidad de la biblioteca (número total de UMI) se redujo cuando los datos escalados y las bibliotecas de diferentes donantes se integraron utilizando IntegrateData. La anotación de grupos se realizó utilizando el conjunto de datos de referencia del Human Lung Cell Atlas67 y el flujo de trabajo TransferData de Seurat publicado en otro lugar23.

Se procesaron muestras cúbicas de pulmón humano fijadas con PFA de aproximadamente 3 mm para la permeabilización y decoloración del tejido según un enfoque publicado recientemente68. Todos los pasos se realizaron con agitación permanente en un rotador de tubos (MACSmixTM, Miltenyi Biotec). Primero incubamos las muestras en 5 ml de solución Quadrol al 25% p/v (N,N,N′,N′-Tetrakis-(2-hidroxipropil)-etilendiamina, Sigma-Aldrich) durante 2 días a 37 °C, seguido de 5 ml de Quadrol al 25 % p/v y solución CHAPS al 10 % p/v ((3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-1propanosulfonato, Sigma-Aldrich) durante 5 días a 37 °C68. Después de la decoloración y permeabilización iniciales, seguimos el protocolo SHIELD para muestras humanas fijadas con PFA69. Por lo tanto, las muestras se incubaron en solución SHIELD-OFF a 4 °C durante 3 días y luego se colocaron en tampón SHIELD-ON y solución SHIELD-Epoxy en una proporción de 1:1 a temperatura ambiente durante 24 h. Luego se completa la conservación SHIELD y lavamos las muestras durante 1 día en PBS con tres cambios de tampón a 4 °C. A continuación, limpiamos activamente las muestras durante 3 días mediante electrotransporte estocástico (SmartClear Pro, LifeCanvas Technologies) y realizamos el mismo paso de lavado que antes.

Para la inmunotinción, las muestras de pulmón se incubaron en tampón de bloqueo (Triton X-100 al 0,2 %/DMSO al 10 %/FCS al 5 %/PBS) a 37 °C durante 1 día y luego en tampón de incubación de anticuerpos (FCS al 0,5 %/FCS al 3 %). DMSO/0,2%Tween-20/PBS) a 37 °C durante 7 días que contienen los respectivos anticuerpos (como se indica para las respectivas muestras). Utilizamos los siguientes anticuerpos y diluciones para la tinción: Sytox-AF488 (1:40.000, Thermo Fisher), ER-TR7-AF546 (1.º 1:200/2.º 1:100, Santa Cruz Biotechnology) o CD3-infrarrojo cercano (NIR). iFluor790 (1:50, AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA, EE. UU.). Después de la tinción, las muestras se lavaron primero con tampón de lavado (Tween-20 al 0,2%/PBS) durante 1 día a 37 °C y con PBS a 4 °C con tres cambios de tampón cada uno. Luego, las muestras inmunomarcadas se incubaron para la coincidencia del índice primero en EasyIndex al 50 % (LifeCanvas Technologies, índice de refracción –RI- 1,456) en ddH2O durante 1 día y segundo en Easy Index al 100 % hasta que se alcanzó la transparencia en 1 a 2 días.

Pegamos ligeramente las muestras de pulmón humano en una placa de plástico y sumergimos la muestra en una solución 100% Easy Index en una cubeta de cuarzo de 5 × 5 × 45 mm (msscientific Chromatographie-Handel GmbH). Para la adquisición de imágenes, sumergimos la cubeta más pequeña que contenía la muestra de pulmón en la cubeta de cuarzo más grande (LaVision Biotec), llena de líquido de sílice fundida con un RI de 1.459 (Laboratorios Cargille). Para adquirir imágenes de láminas de luz utilizamos un Ultramicroscopio II. (LaVision BioTec) acoplado a un cuerpo de zoom Olympus MVX10 que proporciona una relación de zoom de 0,63×–6,3× y un objetivo de inmersión de 2× (Olympus MVPLAPO2XC/0,5 NA [WD = 5,6 mm, corregido]), lo que da como resultado un aumento total que oscila entre 1,36 ×–13,56×. El Ultramicroscope II con una resolución lateral de ~4 µm estaba equipado con una cámara Andor Neo sCMOS con un tamaño de píxel de 6,5 × 6,5 µm² y un módulo láser LaVision BioTec con los siguientes conjuntos de filtros: ex 488 nm, em 520/50 nm; ex 561 nm, em 620/60 nm; ex 785 nm, em 835/70 nm. Utilizamos el ex de 488 nm para la generación de señales autofluorescentes y la detección de la señal nuclear Sytox-AF488, el ex de 561 nm para la detección de la señal ER-TR7-AF546 y el ex NIR de 785 nm para la detección de CD3-iF790. Primero tomamos imágenes de la longitud de onda más larga para evitar el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes y realizamos una adaptación z lineal del ex. Láser de 785 nanómetros. Utilizamos un zoom óptico total de 8,61× y un paso z de 5 µm para todas las adquisiciones. Se adquirieron escaneos de mosaicos más grandes utilizando una superposición del 10% a lo largo de los ejes x e y longitudinales de la muestra de pulmón humano y la potencia del láser se ajustó dependiendo de la intensidad de la señal (para no alcanzar la saturación).

Adquirimos por separado imágenes TIFF en escala de grises de 16 bits para cada canal mediante microscopía de hoja de luz con el software ImSpector (LaVision Biotec). Las pilas tiff se convirtieron (ImarisConverterx64) en archivos Imaris (.ims) y se unieron con Imaris Stitcher. Usamos Imaris (Bitplane) para visualización de imágenes 3D y 2D, creación de instantáneas y generación de películas. Realizamos resta de fondo de acuerdo con el diámetro de las estructuras respectivas para eliminar señales de fondo inespecíficas.

Todos los instrumentos, reactivos, software y algoritmos utilizados para este estudio se detallan en la Tabla complementaria 1.

Durante el período 03/2020 y 09/2020, se incluyeron en este estudio todos los posibles donantes prolongados de COVID-19 con una autopsia en la Charité Universitätsmedizin Berlin, donde se dio el diagnóstico de COVID-19 y el tejido respectivo estaba disponible para el análisis. Se seleccionaron aleatoriamente (emparejados por edad y sexo) casos agudos, crónicos y de control entre los casos con tejido disponible. Se excluyeron todos los donantes con tumor pulmonar, terapia con células madre hematológicas o comorbilidad autoinmune. Utilizamos los mismos criterios de exclusión para los controles, pero con PCR e inmunohistoquímica negativas para SARS-CoV-2 como criterios de inclusión adicionales. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra y la aleatorización adicional no es relevante para nuestro estudio, ya que la estratificación de la muestra se realizó según la duración de la enfermedad para interrogar las diferencias basadas en ese parámetro clínico en particular. Analizamos muestras de tejido postmortal de 17 donantes humanos (4 controles, 3 casos agudos de enfermedad COVID-19, 5 casos de enfermedad COVID-19 crónica y 5 casos de enfermedad COVID-19 prolongada).

Un caso de control analizado tuvo que ser excluido debido a la PCR postmortem y a la prueba inmunohistoquímica de una infección clínica sin complicaciones por SARS-CoV-2.

Se han analizado mediante microscopía multiplexada al menos 2 zonas diferentes de cada muestra. Los experimentos se realizaron en un mínimo de 3 réplicas por grupo de enfermedad. Todos los intentos de replicación tuvieron éxito, excepto dos de las catorce secciones de tejido analizadas por ST, que dieron cantidades muy bajas de ADNc, que sin embargo se usaron para la preparación de la biblioteca, pero no pasaron el control de calidad posterior. Estas dos secciones de tejido y los datos extraídos de ellas no se utilizaron para análisis posteriores ni para la preparación del manuscrito. La evaluación de la tinción histológica e inmunohistoquímica (anotaciones de tejido y puntuación de fibrosis) fue realizada por separado por al menos dos evaluadores independientes que estaban cegados respecto a la duración de la enfermedad. La histología multiplexada, la microscopía electrónica, la microscopía de lámina de luz, la adquisición, el procesamiento y el análisis de datos de snRNAseq y ST no fueron cegados.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism® 9.2.0 (Graph Pad Software, LA Jolla, CA, EE. UU.). Las pruebas utilizadas y los valores p exactos se describen dentro de cada figura y leyenda de la figura. La significación se definió por p <0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de transcriptómica espacial de pacientes/humanos no identificados se han depositado en Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), con el registro GSE190732 y están disponibles públicamente. Los datos de SnRNASeq también se han depositado en GEO (https://doi.org/10.1183/13993003.02725-2021) y están accesibles bajo los registros GSM5958253, GSM5958254, GSM5958255, GSM5958256, GSM5958257, GSM5958258, GSM5958259 y GSM595. 8260. Datos histológicos multiplexados, así como ya que las matrices de características y las coordenadas espaciales necesarias para volver a analizar los datos informados en este estudio están disponibles públicamente en el repositorio de Zenodo bajo DOI: 10.5281/zenodo.7447490 y todos los identificadores vinculados/relacionados. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Este estudio no utilizó ningún código original.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a los pacientes y sus familiares por dar su consentimiento para la autopsia y la investigación posterior. Agradecemos a Ralf Uecker y Gudrun Holland por el soporte técnico. Este estudio fue apoyado por fondos de Deutsche Forschungsgemeinschaft, HA5354/10-1, HA5354/12-1, SPP1937 (HA5354/8-2) y TRR130 P17 para AEH, TRR 130 C01 y SFB 1444 P14 (para AEH y RAN) . La RAN estaba respaldada por la DFG 1167/5-1. HR recibió el apoyo de la DFG (RA 2491/1-1 y CRC 130 TP17). ACH contó con el apoyo de la Alianza Universitaria de Berlín GC2 Global Health (Corona Virus Pre-Exploration Project), BMBF (RAPID y Organo-Strat, alvBarriere-COVID-19), así como DFG (SFB-TR 84, B6 / Z1a), de la Instituto de Salud de Berlín (BIH), Charité 3R y Charité-Zeiss MultiDim. SE, FH, HR y RM contaron con el apoyo de BMBF (Defeat Pandemics, Organo-Strat), FH contó con el apoyo de DFG según la estrategia de excelencia de Alemania EXC-2049-390688087, así como SFB TRR 167 y HE 3130/6-1. BO fue financiado a través del proceso de bioinformática clínica unicelular de BIH. Además, agradecemos a la Fundación Charité (Max Rubner Preis 2016) por el apoyo financiero a CDM-FM que fue apoyado por subvenciones de la Asociación Leibniz (Leibniz Collaborative Excellence, TargArt e ImpACt), el Instituto de Salud de Berlín (BIH) con la Beca Inicial -Caracterización multiómica de la infección por SARS-CoV-2, Proyecto 6, Identificación de objetivos inmunológicos en Covid-19, el estado de Berlín y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER 2014-2021, EFRE 1.8/11, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (CONAN y TReAT).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Josefina Radke

Dirección actual: Instituto de Patología, Universidad de Medicina de Greifswald, Greifswald, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Ronja Mothes, Anna Pascual-Reguant.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Helena Radbruch, Anja E. Hauser.

Departamento de Neuropatología, Charité–Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, 10117, Berlín, Alemania

Ronja Mothes, Carsten Dittmayer, Regina von Manitius, Jenny Meinhardt, Josefine Radke, Frank L. Heppner, Tom Aschman y Helena Radbruch

Immune Dynamics, Centro Alemán de Investigación sobre el Reumatismo (DRFZ), un Instituto Leibniz, Charitéplatz 1, 10117, Berlín, Alemania

Ronja Mothes, Anna Pascual-Reguant, Ralf Koehler, Juliane Liebeskind, Alina Liebheit, Sandy Bauherr y Anja E. Hauser

Departamento de Reumatología e Inmunología Clínica, Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, 10117, Berlín, Alemania

Anna Pascual-Reguant, Juliane Liebeskind, Alina Liebheit y Anja E. Hauser

Instituto de Inmunología Molecular y Clínica, Centro Médico, Universidad Otto-von-Guericke de Magdeburgo, Magdeburgo, Alemania

Lars Philipsen

Plataforma de citometría y bioimagen multiparamétrica (MPBIC), Facultad de Medicina, Universidad Otto-von-Guericke de Magdeburgo, Magdeburgo, Alemania

Lars Philipsen

Centro de Amenazas Biológicas y Patógenos Especiales (ZBS), Instituto Robert Koch, Berlín, Alemania

Michael Laue

Instituto de Patología, Charité–Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Sefer Elezkurtaj y Jana Ihlow

Regulación genética terapéutica, Centro Alemán de Investigación sobre el Reumatismo (DRFZ), un Instituto Leibniz, Berlín, Alemania

Pawel Durek, Frederik Heinrich, Gitta A. Heinz, Gabriela M. Guerra y Mir-Farzin Mashreghi

Unidad Central de Bioinformática (CUBI), Instituto de Salud de Berlín en la Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlín, Alemania

Benedikt Obermayer

Instituto de Salud de Berlín (BIH), Berlín, Alemania

Josefine Radke y Leif E. Sander

Consorcio Alemán contra el Cáncer (DKTK), sitio asociado en Berlín, CCCC (Campus Mitte), Berlín, Alemania

Josefina Radke

Clúster de Excelencia, NeuroCure, Berlín, Alemania

Frank L. Heppner

Centro Alemán de Enfermedades Neurodegenerativas (DZNE) Berlín, Berlín, Alemania

Frank L. Heppner

Departamento de Nefrología y Cuidados Intensivos Médicos, Charité-Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 12203, Berlín, Alemania

Philipp Enghard y Helena Stockmann

Instituto de Virología, Charité–Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin y Centro Alemán para la Investigación de Infecciones, Berlín, Alemania

Julia Schneider y Víctor M. Corman

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Medicina Respiratoria y Cuidados Críticos, Charité-Universitätsmedizin Berlin y Centro Alemán de Investigación Pulmonar (DZL), Berlín, Alemania

Leif E. Sander y Andreas C. Hocke

Plataforma Tecnológica de Genómica, Centro Max Delbrück de Medicina Molecular de la Asociación Helmholtz (MDC), Berlín, Alemania

Thomas Conrado

Imágenes dinámicas y funcionales in vivo, Medicina Veterinaria, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Raluca A. Niesner

Análisis biofísico, Centro Alemán de Investigación sobre el Reumatismo (DRFZ), un Instituto Leibniz, Berlín, Alemania

Raluca A. Niesner

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AEH, HR, APR y RM conceptualizaron el estudio. JM, JR, HR y FLH organizaron el Biobanco. ML, CD, SE, GAH, BO, JI, FH, PE, HS, TA, JS, VC, LES, MF.M., TC, ACH, LP, HR, RN y AEH proporcionaron recursos y experiencia. GMG, JL, AL, RM y APR realizaron experimentos. RvM, FH, PD, RK, JL, AL, RM y APR analizaron los datos. RM, APR, HR y AEH interpretaron los resultados y escribieron el manuscrito. HS, TA, BO, SB, RK, RM, APR, MF.M, RN, HR y AEH revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Anja E. Hauser.

LP está afiliada a BioDecipher GmbH, una empresa que desarrolla sistemas para microscopía de fluorescencia multiplexada. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Richard Enelow, Jay Rappaport y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Mothes, R., Pascual-Reguant, A., Koehler, R. et al. Nichos de tejido distintos dirigen la inmunopatología pulmonar a través de CCL18 y CCL21 en casos graves de COVID-19. Nat Comuna 14, 791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36333-2

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Recibido: 10 de marzo de 2022

Aceptado: 23 de enero de 2023

Publicado: 11 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36333-2

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