Titanio

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 470 (2023) Citar este artículo

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El desarrollo de nuevos biomateriales con propiedades mecánicas sobresalientes y alta biocompatibilidad ha sido un desafío importante en las últimas décadas. Los metales nanocristalinos han brindado nuevas oportunidades en la producción de biomateriales de alta resistencia, pero es necesario mejorar la biocompatibilidad de estos nanometales. En este estudio, presentamos nanocompuestos de metal-proteína como biomateriales de alta resistencia con biocompatibilidad superior. Al titanio se le añaden pequeñas proporciones de albúmina sérica bovina (2 y 5 vol%), una proteína abundante en el cuerpo de los mamíferos, y se sintetizan dos nanocompuestos mediante un severo proceso de deformación plástica de torsión a alta presión. Estos nuevos biomateriales muestran no sólo una alta dureza similar a la del titanio puro nanocristalino, sino que también exhiben una mejor biocompatibilidad (incluida la actividad metabólica celular, los parámetros del ciclo celular y el perfil de fragmentación del ADN) en comparación con el nanotitanio. Estos resultados introducen una vía para diseñar nuevos compuestos biocompatibles empleando compuestos del cuerpo humano.

Los biomateriales están recibiendo considerable atención para diferentes aplicaciones en los últimos años. El desarrollo de biomateriales metálicos para implantes es un tema particularmente crítico tanto desde el punto de vista técnico como de investigación debido al contacto directo de los implantes con los tejidos, huesos y fluidos del cuerpo humano bajo carga. El cuerpo humano es un entorno muy corrosivo y complejo que da lugar a la aparición de diferentes tipos de corrosión cuando se implanta en el cuerpo humano un material artificial que soporte carga1,2,3. El líquido corporal contiene diversos compuestos orgánicos y una notable variedad de proteínas. Hay cerca de 105 proteínas diferentes disponibles en el cuerpo humano, cada una con una función específica. Entre estas proteínas, se informó que la albúmina es la proteína más abundante en el plasma y el líquido sinovial4 y, por lo tanto, está presente en cualquier tejido humano donde se pueda implantar un material artificial.

Una de las etapas iniciales que influye significativamente en la biocompatibilidad es la adsorción instantánea de proteínas de fluidos biológicos sobre superficies de biomateriales1,2. Además, la adsorción de proteínas se considera la primera y más crucial etapa que permite la adhesión de las células a la superficie del biomaterial y, por lo tanto, durante esta etapa se desarrollan fenómenos clínicos relevantes como la osteointegración de los implantes ortopédicos1,2,3,4. La albúmina fue identificada como el aglutinante metálico más fuerte entre las proteínas de la sangre humana, por lo que la adsorción de albúmina en las superficies de los implantes desempeña un papel clave en la determinación de las funcionalidades de la superficie, como la biocompatibilidad, la corrosión y la tribología5. Las proteínas crean una capa gruesa en la superficie del material y las células detectan superficies extrañas a través de esta capa y comienzan a responder. Algunos informes sobre implantes revelaron claramente la presencia de capas que contienen proteínas en la superficie1,6, lo que indica la importancia de la interacción de las proteínas con aleaciones biomédicas a nivel celular.

El titanio y sus aleaciones se han utilizado ampliamente como biomateriales potenciales en muchos implantes diferentes debido a su bajo módulo elástico, alta resistencia a la fatiga, excelente resistencia a la corrosión, mejor biocompatibilidad en comparación con otros biomateriales como aceros inoxidables y aleaciones de Co-Cr7,8 y baja densidad de 4,5 g/cm3, que es aproximadamente la mitad que los aceros inoxidables y las aleaciones de Co-Cr9. Sin embargo, el principal inconveniente del titanio y sus aleaciones es su menor resistencia y dureza en comparación con los aceros inoxidables y las aleaciones de Co-Cr7,8,9. Estudios recientes demostraron que la nanoestructuración del titanio es una solución eficaz para mejorar su resistencia y dureza sin deteriorar su biocompatibilidad10,11.

El uso exitoso de implantes de titanio depende no sólo de propiedades mecánicas como el módulo elástico y la dureza, sino también de la osteointegración en la interfaz hueso-implante12. Sin embargo, debido a la falta de bioactividad de los materiales a base de Ti, no pueden unirse directamente al hueso y promover la formación de hueso nuevo en su superficie en las primeras etapas de la implantación13,14. Para mejorar la osteointegración de materiales basados ​​en Ti se han empleado dos métodos principales basados ​​en modificaciones superficiales: (1) el control de la topografía superficial con cambios físicos y/o químicos15,16; (2) la inmovilización de moléculas bioactivas en la superficie del implante17,18. El segundo enfoque, en el que se utilizan recubrimientos ricos en proteínas como colágeno19 y albúmina sérica bovina (BSA)5,20,21,22, puede mejorar la biocompatibilidad de las aleaciones a base de Ti.

Varios estudios20,21,22,23,24 demostraron los efectos beneficiosos sobre la biocompatibilidad cuando las aleaciones a base de Ti se recubren con proteínas o se exponen a soluciones con altas concentraciones de BSA diluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En las referencias 20,21,22, se demostró que el recubrimiento con BSA inhibe la evolución de hidrógeno y las reacciones de disolución anódica, aumenta la resistencia de las películas protectoras y mejora la adhesión celular al titanio puro y aleaciones basadas en Ti, como Ti-6Al. -4V, Ti-6Al-7Nb y Ti-6Al-4V-1Zr (en % en peso). En una dirección similar, también se demostró que BSA mejora la estabilidad de la película pasiva de la aleación en concentraciones más altas en la aleación Ti-6Al-4V23. En el caso de la aleación Ti-3Cu (en % en peso) expuesta a una solución que contiene proteínas BSA24, la resistencia a la corrosión mejoró y la capacidad antibacteriana se redujo cuando el contenido de BSA aumentó en la solución. Sin embargo, pocos estudios25,26 revelaron que la adsorción de especies proteicas como BSA en la superficie de aleaciones basadas en Ti puede mejorar la liberación de iones y obstaculizar la adhesión de las células.

A pesar de la importancia del recubrimiento proteico para mejorar la biocompatibilidad de los implantes, estos recubrimientos ricos en proteínas tienen una unión débil al sustrato metálico. Debido a una unión tan débil, puede ocurrir delaminación con el tiempo, lo que lleva al fracaso de esta técnica de recubrimiento para una implantación a largo plazo27,28. La inclusión permanente de una segunda fase, como proteínas, en el material metálico puede ser una solución potencial para evitar el problema de la delaminación de los implantes recubiertos de proteínas, pero no ha habido intentos de producir tales compuestos de metal y proteína.

En este estudio, para producir biomateriales con alta resistencia y buena biocompatibilidad para una implantación a largo plazo, las partículas de proteína se insertan directamente como segunda fase en titanio nanoestructurado puro. Los nanocompuestos a granel se producen mediante un método de deformación plástica severa de torsión a alta presión (HPT). Los materiales muestran una alta dureza y una mejor biocompatibilidad que el titanio puro y no sufren problemas de delaminación, que es un problema general del recubrimiento con proteínas. Esta primera introducción de biomateriales compuestos de metal y proteínas abre un nuevo camino para una amplia gama de aplicaciones biomédicas.

Para preparar los biomateriales se utilizó polvo de titanio con un nivel de pureza del 99,9% y tamaños de partículas inferiores a 45 μm y polvos de BSA. BSA se adquirió de Amresco (Solon, OH, EE. UU.) con una pureza del 98 % y se utilizó sin ninguna purificación adicional. El polvo de titanio se mezcló mecánicamente con partículas de BSA en proporciones de 0, 2 y 5% en volumen. Las mezclas de polvo resultantes, como se muestra en las figuras 1a a c, se preconsolidaron bajo una presión aplicada de 300 MPa en forma de disco con un diámetro de 10 mm y un espesor de ~ 1 mm utilizando una prensa hidráulica manual. Luego se aplicó el método HPT a los discos compactados para preparar los nanocompuestos a granel con un buen nivel de mezcla. El método HPT es una técnica de deformación plástica severa en la que una muestra en forma de disco se comprime entre dos yunques bajo alta presión y se induce una tensión de corte al girar uno de los yunques con respecto al otro, como se muestra en la Fig. 1d 29. El proceso HPT se realizó a 2 GPa a temperatura ambiente durante 5 vueltas con una velocidad de rotación de 1 vuelta por minuto. Se seleccionó el método HPT para la síntesis de composites por tres razones principales. (1) Este método ha sido bien establecido como un proceso capaz de producir materiales nanoestructurados con una alta densidad de defectos reticulares30,31,32,33,34. (2) El método se puede utilizar para producir compuestos a granel a partir de mezclas de polvo a temperatura ambiente33,34. (3) Los materiales nanoestructurados a base de Ti procesados ​​por HPT pueden mostrar buena biocompatibilidad y alta resistencia32,33,34,35.

( a, b ) imágenes SEM en modo BSE y (c) mapeos elementales EDS correspondientes de Ti + 5% en volumen de BSA antes del procesamiento HPT. (d) Esquema del método HPT y sus yunques29. ( d, f, g ) Imágenes SEM con diferentes aumentos en modo BSE para Ti + 5% en volumen de compuesto BSA después de 5 vueltas de HPT a 2 GPa.

Después del procesamiento HPT, las muestras se pulieron hasta obtener una superficie similar a un espejo para las investigaciones microestructurales, mecánicas y de biocompatibilidad. Los resultados de las propiedades mecánicas y la biocompatibilidad de las muestras procesadas con HPT se compararon con un titanio puro a granel de grano grueso de referencia (99,9%) con un tamaño de grano promedio de 200 μm que se recoció a 1073 K durante 1 h.

Se utilizó la técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM) para investigar las características de la microestructura a nivel micrométrico. Las imágenes SEM se tomaron utilizando señales de electrones secundarios y retrodispersados ​​(SE y BSE) bajo un voltaje de aceleración de 15 kV con un microscopio JEOL JSM-7900F o 25 kV con un microscopio FEG Philips XL-30 equipado con un Bruker Nano X-Flash. Detector de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) 6|60. Las imágenes SEM se tomaron a 4 mm de distancia del centro de los discos procesados ​​por HPT.

La microscopía electrónica de transmisión y transmisión de barrido (TEM y STEM) se realizó con un voltaje de aceleración de 200 kV utilizando un microscopio con corrección de aberración (JEOL JEM-ARM200F). Para TEM y STEM, se cortaron discos de 3 mm de diámetro de 2 a 5 mm de distancia del centro del disco procesado con HPT utilizando una máquina de descarga eléctrica. Los discos de 3 mm se rectificaron primero hasta un espesor de 100 µm con papeles abrasivos y luego hasta un espesor menor para lograr transparencia electrónica mediante un pulidor electroquímico de doble chorro convencional usando una solución de 5% HClO4, 25% C3H3(CH2)2CH2OH y 70 % CH3OH, bajo un voltaje de 12 V a una temperatura de 263 K. El examen microestructural mediante TEM y STEM se realizó mediante imágenes de campo brillante y oscuro (BF y DF), imágenes de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF), Difracción de electrones de área seleccionada (SAED) y mapeos EDS.

Para el análisis de la estructura cristalina, las muestras se examinaron mediante el método de difracción de rayos X (DRX) utilizando un difractómetro X'Pert Panalytical equipado con un monocromador de grafito que funciona a 45 kV y 40 mA con radiación Cu Kα (longitud de onda de λ = 0,15406 nm).

Para el análisis de propiedades mecánicas, la microdureza Vickers se midió utilizando una carga de 500 gf y un tiempo de permanencia de 15 s en la superficie superior de las muestras en cuatro direcciones radiales diferentes desde el centro hasta los bordes de los discos procesados ​​con HPT.

La biocompatibilidad se evaluó mediante dos pruebas principales: (1) ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) modificado; (2) análisis del ciclo celular y perfil de fragmentación del ADN mediante citometría de flujo. En la secuencia, se presentan detalles de las pruebas de biocompatibilidad.

Las líneas celulares de preosteoblastos de ratón (MC3T3-E1) se mantuvieron en medio esencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, EE. UU.) en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2 a 310 K. Las células MC3T3-E1 fueron proporcionadas por el Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP), São Paulo , Brasil.

Se tripsinizaron células MC3T3-E1 con una confluencia del 80% y luego se inactivaron con α-MEM y se contaron en un contador automático Countess II (Thermo Fisher Scientific Inc., Walthan, MA, EE. UU.). Los discos procesados ​​con HPT se dispusieron en placas de 24 pocillos (1 disco por pocillo). Los discos se esterilizaron mediante exposición durante la noche a luz ultravioleta en una cabina de bioseguridad y se colocaron 60 µl de suspensión celular (1 x 105 células) en la superficie de los discos. La placa se incubó en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2 a 310 K durante un período de 2 h. Luego, se añadió 1 ml de α-MEM a cada pocillo y la placa se incubó en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2 a 310 K.

El ensayo MTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como indicador de la viabilidad, proliferación y citotoxicidad celular. El ensayo MTT se basa en la reducción de una sal de tetrazolio amarilla, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cristales de formazán de color púrpura mediante células metabólicamente activas. Después de 48 h de siembra en placas, se aspiraron los medios de cultivo y se añadió MTT (0,5 mg/ml en PBS) a las células y luego se incubaron durante 3 h en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 a 310 K. Se descargó el medio de crecimiento y Se agregaron 250 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo para disolver el MTT. La absorbancia de la luz se determinó a 570 nm utilizando un lector de placas multipocillo espectrofotométrico de barrido (F5 Microplate Reader, Molecular Probes).

Para los ensayos de citometría de flujo, los discos procesados ​​con HPT se colocaron en una placa de 24 pocillos (1 disco por pocillo), se esterilizaron con luz ultravioleta durante 12 h y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato. Se sembraron aproximadamente 1,8 x 105 células en cada disco. Después de 48 h de cultivo en placas, las células se recogieron y se lavaron con PBS. Se usó etanol frío (70%) para fijar las células durante 30 minutos y se usaron 50 μg/ml de yoduro de propidio (PI) diluido en PBS que contenía 1 mg/ml de RNasa para teñir durante 30 minutos. Las células se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad. Los porcentajes de células en diferentes fases del ciclo se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo basado en núcleos teñidos con PI utilizando el software Accuri™ C6 (BD Biosciences).

Las Figuras 1a a c muestran imágenes SEM que incluyen el mapeo elemental EDS de elementos seleccionados del disco compacto antes del procesamiento HPT para compuestos que contienen 5% en volumen de BSA. En este caso, la superficie de esta muestra no recibió ningún procedimiento de pulido. Como puede verse por el contraste de composición en las imágenes de BSE (Fig. 1a, b), existe una mezcla razonable entre las partículas de titanio y BSA a nivel micrométrico. Las partículas grises se refieren al titanio con dimensiones que oscilan entre 10 y 45 μm, mientras que las partículas negras se refieren a la proteína BSA. BSA es un polímero lineal que contiene átomos de C, H, O, N y S4. El mapeo elemental que se muestra en la Fig. 1c confirma que las partículas negras corresponden a la proteína BSA que contiene átomos de carbono rodeados por una matriz de titanio.

Las Figuras 1e-g muestran imágenes de BSE para el compuesto que contiene 5% en volumen de BSA después del procesamiento HPT. Como lo indica el contraste de composición y el análisis EDS, las regiones negras están relacionadas con la proteína BSA. Estas imágenes muestran que después de una severa deformación plástica llevada a cabo por el procesamiento HPT, la proteína BSA se mezcla con partículas de titanio formando capas de proteína bien definidas que se distribuyen por toda la muestra, mientras que la fase de titanio mantiene su red tridimensional. La capacidad del HPT para formar una estructura en capas de titanio y BSA es una consecuencia del efecto de deformación por corte en la evolución microestructural balística del titanio y BSA, mientras que la alta presión hidrostática facilita la codeformación de dos componentes con diferentes estructuras y propiedades. Esta capacidad del método HPT ya se empleó para producir diversos compuestos a base de Ti, como compuestos de metal-metal36, compuestos de metal-cerámica37 y compuestos de metal-carbono38. Aquí, cabe señalar que las microestructuras que se muestran en las figuras 1e a g también se observaron cuando se examinó el compuesto Ti-BSA mediante SEM desde la vista transversal, una característica que generalmente se observa en los metales procesados ​​con HPT30.

Los exámenes de la microestructura con mayor aumento utilizando STEM-HAADF y EDS, como se muestra en las figuras 2a, b, confirman que el titanio y la BSA tienen una buena unión a escala nanométrica. Aunque se necesitan futuros cálculos teóricos para aclarar la naturaleza de este enlace, sus características deberían ser similares a las observadas para la absorción de proteínas en los implantes de titanio en el cuerpo humano. El enlace entre el titanio y la proteína generalmente sigue dos pasos: (1) enlace de hidrógeno y (2) transferencia de protones39. Algunos estudios sugirieron que dicho enlace se ve reforzado por la interacción del grupo OH con el titanio40,41, mientras que las simulaciones de dinámica molecular informaron la importancia de las interacciones electrostáticas de los grupos amida y carboxilo en el enlace42,43.

Análisis STEM y TEM para compuesto Ti + 5 % en volumen de BSA después de 5 vueltas de HPT a 2 GPa. (a) imagen HAADF y (b) y mapeo EDS correspondiente con Ti; ( c, f ) imágenes TEM-BF; (d,g) patrones de DESA correspondientes a (c,f); y (c) imagen TEM-DF.

Se empleó el análisis TEM para explorar más características de la microestructura del compuesto a nivel submicrométrico y nanométrico. La Figura 2 muestra imágenes TEM representativas del compuesto con 5% en volumen de BSA después del procesamiento HPT. Las imágenes BF y DF (Fig. 2c, e) muestran la presencia de varios granos ultrafinos de titanio con tamaños nanométricos o submicrométricos con un tamaño de grano promedio de 90 nm. El patrón SAED (Fig. 2d) tomado de la región que se muestra en la Fig. 2c muestra anillos bien definidos, lo que sugiere la presencia de granos ultrafinos con orientaciones aleatorias en la región seleccionada. Los anillos aparentes en la Fig. 2d pertenecen al titanio con estructura hexagonal compacta (HCP). Una imagen BF (Fig. 2f) junto con el patrón SAED respectivo (Fig. 2g), tomada de una región del compuesto que contiene la proteína BSA, muestra la naturaleza amorfa de BSA que está bien caracterizada por el patrón de anillo de halo que se muestra en la imagen. Patrón DESA.

La Figura 3 muestra los patrones de XRD para titanio puro y para las muestras que contienen 2 y 5% en volumen de BSA después del procesamiento con HPT. Como se puede observar, los patrones de XRD de todas las muestras muestran la presencia de una sola fase que se refiere a la estructura hexagonal de titanio (P63/mmc) en buena concordancia con el análisis TEM. No aparecen nuevas fases en los patrones XRD después del procesamiento HPT. La única diferencia entre los patrones XRD está relacionada con la disminución de las intensidades de los picos XRD con el aumento de la proporción BSA.

Patrones de XRD para titanio puro y para composites que contienen 2 y 5% en volumen de BSA después de 5 vueltas de HPT a 2 GPa.

Para tener una idea de las propiedades mecánicas de las muestras después de la adición de proteína BSA mediante procesamiento HPT, se comparó la microdureza Vickers obtenida a 4 mm del centro de los discos, donde la deformación por corte es máxima. La Figura 4 muestra los valores promedio de microdureza para las muestras después del procesamiento HPT. Los valores obtenidos para la microdureza son bastante similares entre las tres muestras procesadas con HPT, lo que demuestra que las pequeñas adiciones de BSA hasta el 5% en volumen no influyen negativamente en la dureza. Los valores medidos están en el rango de 344 a 353 HV, lo que concuerda con los valores encontrados en la literatura para aleaciones a base de Ti procesadas por HPT34,44. La Figura 4 muestra que la dureza de los compuestos de Ti-BSA es más del doble que la dureza del titanio recocido de grano grueso de referencia.

Microdureza Vickers para titanio puro y para nanocompuestos que contienen 2 y 5 % en volumen de BSA producidos por 5 vueltas de HPT a 2 GPa en comparación con la dureza del titanio recocido de grano grueso.

Aquí cabe mencionar dos puntos relacionados con las propiedades mecánicas. Primero, la dureza fue más baja en el centro de los discos, pero aumentó al aumentar la distancia desde el centro del disco, como se muestra en la Fig. S1 de Información de respaldo. Estas heterogeneidades, que se deben a un aumento en la deformación por corte al aumentar la distancia desde el centro del disco, se pueden evitar aumentando el número de vueltas de modo que los valores de dureza desde el centro del disco hasta el borde se saturen hasta los estados estacionarios29,30. En segundo lugar, mientras que la consolidación de polvos de titanio puro mediante HPT dio como resultado un límite elástico de tracción de 1 GPa y una ductilidad del 12%45, la presencia de la fase proteica no produjo ductilidad bajo tensión, un hecho que generalmente se observa en los compuestos metal-cerámicos. A pesar del buen rendimiento mecánico de los compuestos bajo cargas de compresión, siempre se debe considerar su ductilidad limitada bajo tensión cuando se utilizan para cualquier aplicación, incluidas las aplicaciones biomédicas46.

La viabilidad celular de los nanocompuestos después del procesamiento HPT se evaluó mediante experimentos de cultivo celular in vitro empleando células MC3T3-E1. Los resultados de la evaluación de biocompatibilidad mediante el ensayo MTT se muestran en la Fig. 5. Cabe señalar que una mayor absorbancia de luz en la Fig. 5 indica una mayor actividad metabólica celular. En primer lugar, como se puede ver claramente en la Fig. 5, todas las muestras procesadas por HPT presentan una biocompatibilidad superior en comparación con la referencia de titanio de grano grueso. En una dirección similar, Refs32,34,35 también mostró la mejora de la biocompatibilidad en aleaciones basadas en Ti después del procesamiento HPT. Además, entre las muestras procesadas por HPT en la Fig. 5, las muestras que contenían BSA mostraron una biocompatibilidad superior en comparación con aquellas muestras sin BSA. La mejora en la biocompatibilidad en las muestras procesadas con HPT parece ser proporcional al contenido de BSA y la muestra con 5% en volumen de BSA muestra el mejor comportamiento de biocompatibilidad. Dado que las proteínas adsorbidas en la superficie del implante median las interacciones entre la superficie celular, incluida su diferenciación y proliferación, normalmente se espera que se logre un mejor proceso de osteointegración y, en consecuencia, una excelente integración tisular en los nanocompuestos de Ti-BSA, especialmente en las primeras etapas. de implantación.

Ensayo de viabilidad de células MTT examinado mediante absorbancia de luz a 570 nm para titanio puro y para nanocompuestos que contienen 2 y 5 % en volumen de BSA producido por 5 vueltas de HPT a 2 GPa en comparación con la dureza del titanio recocido de grano grueso. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

La Figura 6 muestra el perfil del ciclo celular de las células MC3T3-E1 para las muestras procesadas por HPT, incluida una muestra de referencia de titanio. Las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI), la fluorescencia emitida sirvió como señal de pulso y se determinó el área de señal (FL2-A). Para el análisis del ciclo celular, se recogieron 10.000 eventos en el histograma de FL2-A. En la Fig. 6a, los datos de PI están en un histograma con el recuento de células en el eje y y la intensidad de fluorescencia de PI en el eje x. El histograma muestra el número de celdas en tres fases diferentes: G0/G1; S y G2/M durante 48 h. Como se puede observar en la Fig. 6b, el número de células presentadas en las fases G0/G1, S y G2/M es bastante similar entre todas las muestras, lo que indica que la adición de BSA no promovió ninguna distorsión o anomalía, como aumentar o disminuir. el número de células en diferentes fases del perfil del ciclo. En otras palabras, el número de células en cada fase se mantiene inalterado durante el perfil del ciclo independientemente de la composición o ruta de procesamiento.

Perfil del ciclo celular de células MC3T3-E1. (a) Histograma representativo de las muestras que muestran la distribución de células en las fases individuales del ciclo celular en las fases G0/G1 (azul), S (roja) y G2/M (verde). (b) Análisis cuantitativo de la distribución o proporción del número de células en cada fase, realizado a partir de al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

La Figura 7 muestra la fragmentación del ADN de las células MC3T3-E1 para las muestras procesadas por HPT, incluida una referencia de titanio. En la Fig. 7a, el histograma de fragmentación del ADN celular revela que las muestras presentan valores en el rango de 1,5 a 2,0% para la fragmentación del ADN. Esto indica que la adición de BSA o incluso el procesamiento HPT no induce un comportamiento inesperado en las muestras, especialmente porque los valores mostrados en la Fig. 7b están dentro de un rango muy estrecho para admitir cambios significativos. Por lo tanto, similar a la conclusión extraída del análisis del ciclo celular, la adición de BSA al titanio no induce la apoptosis en las células MC3T3-E1 al aumentar la fragmentación del ADN después de ser procesado por HPT.

Fragmentación del ADN de células MC3T3-E1. ( a ) Histogramas representativos del porcentaje de fragmentación celular. (b) El número de células con ADN fragmentado se muestra como porcentaje. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

En la presente investigación, se introdujeron nanocompuestos de metal y proteínas con alta resistencia y buena biocompatibilidad para su implantación a largo plazo. Los nanocompuestos son mezclas de un metal biocompatible como el titanio y pequeñas cantidades de una proteína endógena como el 2 y el 5% en volumen de BSA. Se seleccionó el método HPT para sintetizar estos nuevos compuestos porque garantiza un buen nivel de mezcla a nivel nanométrico entre las dos fases y logra la nanoestructura deseable con alta dureza para aplicaciones biomédicas.

La caracterización inicial de los nanocompuestos de metal-proteína realizada mediante análisis SEM, STEM, TEM y XRD reveló aspectos microestructurales interesantes de estos nuevos biomateriales. Los compuestos mostraron un buen nivel de mezcla entre titanio y proteína BSA junto con la presencia de una estructura nanocristalina que contiene granos ultrafinos de titanio con un tamaño de grano promedio de 90 nm. La producción de granos ultrafinos y materiales nanocristalinos que exhiben una mayor dureza es uno de los aspectos más atractivos del HPT para aplicaciones de biomateriales29,30,31,32,33,34,35. No se identificaron nuevas fases en los nanocompuestos de metal-proteína después del proceso HPT, lo que indica que la alta dureza se debe a la nanoestructuración y no a la formación de la fase ω-Ti45. Debido a estas características microestructurales, los nanocompuestos de metal y proteína mostraron niveles de dureza dos veces superiores a la dureza del titanio de grano grueso de referencia. Además, la adición de BSA (hasta un 5% en volumen de BSA) no influyó negativamente en la dureza, lo que confirma que la adición de proteínas en pequeñas cantidades es una solución práctica para desarrollar biomateriales de alta resistencia.

La biocompatibilidad de los nanocompuestos de metal y proteína después del procesamiento HPT se probó mediante experimentos de cultivo celular directo empleando células MC3T3-E1. Los resultados mostraron que el nanocompuesto de metal-proteína que contenía 2 y 5% en volumen de BSA presentaba una biocompatibilidad superior en comparación con las referencias de titanio puro nanocristalino y de grano grueso. Más allá de eso, el compuesto que contenía 5% en volumen de BSA mostró el mejor comportamiento de biocompatibilidad entre todas las muestras. Otros aspectos importantes relacionados con la interacción de las células con el nanocompuesto metal-proteína también se mostraron en el perfil del ciclo celular y los resultados de la fragmentación del ADN. Esas pruebas indicaron pruebas claras de que la adición de BSA al titanio no indujo ninguna distorsión o anomalía como aumentar o disminuir el número de células en diferentes fases del perfil del ciclo y tampoco indujo la apoptosis en las células MC3T3-E1 por aumentando la fragmentación del ADN después de ser procesado por HPT. La biocompatibilidad superior de los nanocompuestos de metal-proteína se puede atribuir a la presencia de proteínas BSA en todo el material, incluidas sus superficies, que interactúan con las células MC3T3-E1 y muestran una excelente proliferación y adhesión celular. Cabe señalar que, aunque el aumento de temperatura durante el HPT tiene una importancia menor para provocar la desnaturalización térmica47,48, la desnaturalización en frío y el proceso de desarrollo de proteínas de BSA pueden ocurrir bajo una presión alta de 2 GPa, como se sugiere en publicaciones anteriores49,50. A pesar de estos posibles cambios estructurales tridimensionales bajo alta presión, el BSA sigue siendo eficaz para mejorar la biocompatibilidad en los compuestos actuales de Ti-BSA.

Este efecto positivo de biocompatibilidad debido a la presencia de BSA en aleaciones a base de Ti concuerda bien con el efecto informado del recubrimiento proteico en los implantes20,21,22,23,24. Mientras que los implantes recubiertos de proteínas sufren delaminación durante mucho tiempo, en este estudio la proteína BSA se introdujo como una segunda fase en titanio mediante consolidación en frío mediante el proceso HPT. Por lo tanto, se espera que esta nueva familia de nanocompuestos de metal y proteínas sea mucho menos propensa al problema de la delaminación, aunque se requieren pruebas a largo plazo para confirmar este problema. Debido a que la consolidación en frío mediante HPT es aplicable a casi cualquier tipo de compuestos, este estudio abre un camino para el diseño y la síntesis de una amplia gama de biomateriales nanocompuestos de proteínas metálicas.

En este estudio, presentamos nanocompuestos de metal-proteína como nuevos biomateriales con alta dureza y excelente biocompatibilidad. Los nanocompuestos se sintetizaron mezclando titanio metálico puro con albúmina sérica bovina (BSA), una proteína endógena de los mamíferos, mediante torsión a alta presión. De este estudio se extrajeron las siguientes conclusiones.

La microscopía electrónica mostró un buen nivel de mezcla entre el titanio y la proteína BSA, mientras que el tamaño de grano del titanio estaba bien a nivel nanométrico.

La microdureza de los nanocompuestos de metal y proteínas era similar a la del titanio puro nanocristalino y más del doble que la del titanio puro de grano grueso.

La difracción de rayos X mostró que la adición de BSA y el procesamiento posterior no promovieron la formación de nuevas fases en el material.

La viabilidad celular de las muestras, evaluada mediante experimentos de cultivo celular in vitro utilizando células MC3T3-E1, demostró que la adición de un 5% en volumen de BSA da como resultado la mejor biocompatibilidad debido a la mayor proliferación celular promovida por la presencia de biomoléculas de BSA.

La adición de BSA no promovió ninguna alteración en el perfil celular ni la fragmentación del ADN, lo que indica que el biomaterial aquí estudiado sería una excelente opción para ser utilizado como implante de alta dureza y alta biocompatibilidad.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras del MEXT, Japón (JP19H05176, JP21H00150 y JP22K18737) y de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), Brasil (2019/06951-3). Nos gustaría agradecer a la Prof. Cecilia Helena de Azevedo Gouveia del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP) por proporcionar las células MC3T3-E1.

Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad de Campinas (FCA-UNICAMP), Pedro Zaccaria, Limeira, 130013484-350, Brasil

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Kaveh Edalati

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Augusto Ducati Luchessi

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RF: Conceptualización, Metodología, Validación, Escritura; KE: Conceptualización, Metodología, Validación, Escritura; KDP: Metodología, Validación, Documento de Redacción; ADL: Conceptualización, Metodología, Validación, Escritura.

Correspondencia a Ricardo Floriano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Floriano, R., Edalati, K., Pereira, KD et al. Nanocompuestos de proteína de titanio como nuevos biomateriales producidos por torsión a alta presión. Representante científico 13, 470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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Recibido: 20 de julio de 2022

Aceptado: 19 de diciembre de 2022

Publicado: 10 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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