Estrecho vínculo genético de genes que causan necrosis híbrida y aislamiento de polinizadores entre especies jóvenes

Nature Plants volumen 9, páginas 420–432 (2023)Cite este artículo

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Los mecanismos de aislamiento reproductivo que causan la diversificación fenotípica y eventualmente la especiación son un tema importante de la investigación evolutiva. La necrosis híbrida es un mecanismo de aislamiento poscigótico en el que se desarrolla la muerte celular en ausencia de patógenos. A menudo se debe a la incompatibilidad entre proteínas de dos padres. Aquí describimos un caso único de necrosis híbrida debido a una incompatibilidad entre los loci de los cromosomas 2 y 7 entre dos especies de Petunia aisladas por polinizadores. En la línea necrótica se inducen respuestas inmunitarias típicas, así como respuestas de estrés del retículo endoplásmico. El locus en el cromosoma 2 codifica ChiA1, una quitinasa/lisozima GH18 bifuncional. La actividad enzimática de ChiA1 es prescindible para el desarrollo de necrosis. Proponemos que la expresión extremadamente alta de ChiA1 implica un circuito de retroalimentación positiva entre los loci de los cromosomas 2 y 7. ChiA1 está estrechamente vinculado a genes importantes implicados en la adaptación a diferentes polinizadores, una forma de aislamiento precigótico. Este vínculo de barreras pre y poscigóticas fortalece el aislamiento reproductivo y probablemente contribuye a una rápida diversificación y especiación.

La especiación depende de la evolución de las barreras reproductivas que reducen el flujo de genes entre poblaciones previamente entrecruzadas1,2,3. En las plantas, el aislamiento mediado por polinizadores constituye una barrera de aislamiento precigótica crucial4. Las preferencias de distintas clases de polinizadores por conjuntos de rasgos florales como el color, la morfología, el aroma y la producción de néctar se consideran una fuerza impulsora en la rápida diversificación de las angiospermas5. Estos conjuntos coincidentes de rasgos florales se denominan síndromes de polinización. Sin embargo, la preferencia de los polinizadores por un tipo de flor rara vez es absoluta y a menudo se observa hibridación entre especies (incipientes). Así, la especiación de las plantas generalmente implica la acumulación de múltiples barreras reproductivas3.

En las plantas, la necrosis híbrida (HN) es una barrera de aislamiento post-cigótica en la que los híbridos muestran hojas necróticas y crecimiento deficiente6,7. Muchos de los casos reportados fueron causados ​​por interacciones epistáticas nocivas entre alelos en dos o más loci, creando una barrera post-apareamiento que reduce la aptitud en los híbridos pero no en los padres8. La HN a menudo involucra genes que codifican componentes del sistema inmunológico9,10. Por ejemplo, muchos casos notificados de HN en Arabidopsis se deben a combinaciones inadecuadas de proteínas repetidas ricas en leucina (NLR) del dominio de unión de nucleótidos, que son actores clave en los sistemas inmunológicos tanto de plantas como de vertebrados11,12,13,14.

Previamente hemos estudiado las bases genéticas de la evolución de los síndromes de polinización en el género sudamericano Petunia (Solanaceae). Petunia axillaris (P. axillaris) está ampliamente distribuida en el sur de América del Sur, mientras que Petunia exserta (P. exserta) es una especie altamente endémica que se encuentra exclusivamente en refugios con sombra en la Región de Guaritas de Rio Grande do Sul, Brasil15. P. axillaris tiene flores blancas, fragantes, absorbentes de rayos ultravioleta (UV) y es polinizada por polillas de halcón16,17, mientras que P. exserta tiene flores rojas, sin olor, con estambres y estigmas extendidos y es polinizada por colibríes15,18. Se descubrió que genes individuales subyacentes a los principales loci de rasgos cuantitativos (QTL) para la absorción de rayos UV (MYB-FL), la producción de olores (CNL1) y la longitud del pistilo (EOBII) estaban estrechamente vinculados en la denominada región supergénica en el cromosoma 219,20,21. ,22. Se cree que un vínculo genético tan estrecho impide la disolución de los síndromes de polinización por recombinación. Se cree que las dos especies evolucionaron recientemente a partir de un ancestro común que probablemente fue polinizado por la polilla de halcón23,24,25. Los híbridos naturales están presentes en algunas localidades de la Región de Guaritas donde las dos especies son simpátricas, lo que demuestra que las barreras reproductivas están incompletas18,25,26.

En este artículo, describimos un caso de HN en un cruce entre P. axillaris y P. exserta. Los síntomas necróticos están asociados con una combinación perjudicial entre dos loci ubicados en el cromosoma 2 y el cromosoma 7. Mostramos que el locus en el cromosoma 2 codifica ChiA1, una quitinasa/lisozima bifuncional con un papel importante en la inmunidad desencadenada por patrones contra hongos y bacterias27. Discutimos la posible relevancia del estrecho vínculo de ChiA1 con las barreras de aislamiento precigóticos.

La línea de introgresión IL5 se deriva de un cruce entre P. axillaris N polinizada por polilla de halcón y P. exserta polinizada por colibrí28. Se segrega para una región de P. axillaris de baja recombinación en el cromosoma 2 en un fondo que de otro modo sería P. exserta (Fig. 1a). En esta denominada región supergénica se identificaron previamente varios genes importantes que afectan los rasgos del síndrome de polinización19,20,21,22. Inesperadamente, las progenies de IL5 que son homocigotas para P. axillaris N en la región supergénica (en adelante llamada IL5-Ax) mostraron síntomas necróticos que afectan fuertemente el crecimiento de las plantas (Fig. 1b) y la producción de flores (Fig. 1c). Las plantas IL5-Ex (homocigotas para P. exserta en la región supergénica) estaban sanas. Los síntomas necróticos en IL5-Ax se pueden observar tan pronto como 38 días después de la siembra (Datos ampliados, Fig. 1a). Los síntomas también se observaron en plantas heterocigotas para la introgresión (IL5-Het), pero fueron más leves que en las plantas IL5-Ax, lo que sugiere semidominancia (Fig. 1d). La necrosis se asoció con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y mayores niveles de expresión de genes clave relacionados con la patogénesis (Fig. 1e y Datos ampliados Fig. 1b, c). Estos datos son consistentes con la HN, en la que se desencadena una respuesta inmune en ausencia de patógenos10. Los genes marcadores de estrés del retículo endoplásmico (ER), por ejemplo, dos genes codificadores de proteínas de unión luminal, BiP4 y BiP5, y el factor de transcripción bZIP60, fueron altamente inducidos en la línea necrótica (Datos ampliados, figura 1d), lo que sugiere muerte celular inducida por estrés del ER. puede desempeñar un papel en el desarrollo de HN30.

a, Diagrama que muestra los genotipos de las versiones homocigotas de IL5. El color amarillo indica la región homocigótica de P. axillaris N y el color rojo indica la región homocigótica de P. exserta. Los siete cromosomas se muestran en orden de izquierda a derecha. b, Imágenes de plantas representativas de IL5-Ex e IL5-Ax 13 semanas después de la siembra. c, Análisis de producción de flores en plantas IL5-Ex e IL5-Ax. El número total de flores se registró durante 6 semanas después del desarrollo de la primera flor (~10 semanas después de la siembra) en cada genotipo. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (sd) (n = 5 para plantas IL5-Ax; n = 6 para plantas IL5-Ex). ***P < 0,001; Prueba t de Student bilateral (P = 0,0002). d, Imágenes de plantas representativas de IL5-Ex, IL5-Het e IL5-Ax 10 semanas después de la siembra. e, Evaluación de la producción de ROS mediante tinción con DAB de una planta representativa de IL5-Ax de 5 semanas. El DAB se oxidó con peróxido de hidrógeno (ROS) y se tiñó de marrón. El experimento se repitió dos veces con resultados similares (n = 3).

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La HN a menudo resulta de incompatibilidades entre loci genéticos que han divergido con el tiempo y se reúnen en híbridos10. Tales interacciones pueden involucrar pares de genes nucleares o interacciones núcleo-citoplasmáticas31,32. Por lo tanto, generamos poblaciones F2 recíprocas derivadas de P. axillaris N y P. exserta para diseccionar la arquitectura genética de HN e identificar los loci que interactúan con la región del cromosoma 2. Ambas poblaciones mostraron distribuciones comparables de puntuaciones de HN, es decir, aproximadamente tres cuartas partes de las plantas no mostraron síntomas y una cuarta parte de las plantas mostraron síntomas. La distribución similar de las puntuaciones de HN en las dos poblaciones indica que los loci que controlan HN son nucleares, ya que la herencia citoplasmática es unidireccional (Fig. 2a, b). Se utilizó la secuenciación masiva de ARN segregante (BSR-seq) para localizar las regiones genómicas que causan la HN. Se detectaron fuertes señales asociadas con el fenotipo necrótico en los cromosomas 2 y 7 (Fig. 2c y Datos ampliados, Fig. 2). A estos loci los llamamos HNe2 y HNe7. La necrosis se desencadena por una combinación de alelos N de P. axillaris en HNe2 y alelos de P. exserta en HNe7 (Fig. 2c y Datos ampliados Fig. 2) de acuerdo con la composición genética de IL5-Ax (Fig. 1a) .

a, Fenotipo típico de las plantas F2 13 semanas después de la siembra. Las plantas se clasificaron en grupos sanos o necróticos. b, Distribución de las plantas F2 clasificadas cualitativamente según a. Se fenotiparon un total de 384 plantas de cada una de las poblaciones F2. Pax, P. axillaris N; Pex, P. exserta. c, mapeo de QTL utilizando el método de secuenciación de ARN segregante en masa que muestra regiones con una diferencia excesiva en la frecuencia de alelos entre el grupo de individuos necróticos y el grupo de individuos sanos. Un valor alto en el eje Y indica que muchas de las posiciones de SNP en una ventana presentan una diferencia de frecuencia alélica fuera de los umbrales cuantiles de todo el genoma. Los umbrales se establecen en los cuantiles de todo el genoma 0,05 y 0,95 (línea marrón) y 0,01 y 0,99 (línea amarilla). Las ventanas escalonadas incluyen 100 SNP.

Para reducir el intervalo que transporta HNe2, se llevó a cabo un enfoque de mapeo fino mediante la búsqueda de progenies recombinantes de IL5-Het. La relación entre la segregación fenotípica de HN y el genotipo de las líneas recombinantes condujo a un primer intervalo de 8,7 Mb (Fig. 3a y Tabla complementaria 1). Luego, los puntos de interrupción de la recombinación de diez de las líneas más informativas se caracterizaron con precisión mediante la secuenciación del genoma completo, lo que dio como resultado un intervalo de 1,74 Mb (Fig. 3a y Datos ampliados, Fig. 3). Como esta región todavía contiene 60 genes (Tabla complementaria 2), se realizó un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) de tejidos foliares de plantas IL5-Ax e IL5-Ex para investigar su relevancia funcional sobre la base de la expresión. Entre los 34 genes expresados ​​en la región candidata (leer recuentos >100 en al menos una de las muestras; Tabla complementaria 3), 8 se expresaron diferencialmente (q <0,001), incluidos 4 genes que se sabe que desempeñan un papel en las interacciones entre plantas y patógenos: ChiA1, ChiA2, FMO1 y CNGC1 (Tabla 1 y Tabla complementaria 4).

a, Diagrama que muestra la clonación basada en mapas de HNe2. En primer lugar, el locus HNe2 se asignó a una región de 8,7 Mb en el cromosoma 2. Para obtener más detalles, consulte Métodos y tablas complementarias 1 a 4. b, c, VIGS de los cuatro genes candidatos seleccionados para HNe2: fenotipos de hojas representativos de una rama que surgen después del tratamiento con ChiA1 VIGS y el tratamiento con VIGS de control vacío en IL5-Ax; las hojas se muestran en orden de arriba a abajo; barra de escala, 1 cm (b). Proporción de área amarilla de hojas de plantas IL5-Ax después de VIGS de ChiA1, ChiA2, FMO1, CNCG1 y control vacío; Se utilizaron cinco réplicas biológicas para cada tratamiento (n = 5 plantas). Los síntomas se cuantificaron sobre la base de la relación del área con color amarillo en comparación con el área foliar total. Un valor más alto indica una mayor proporción de superficie amarilla. Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba de diferencias honestamente significativas (HSD) de Tukey); para los valores de P, consulte los datos fuente (c). d,e, Sobreexpresión transitoria de ChiA1Ax en hojas de plantas IL5-Ex: un fenotipo representativo de la hoja de IL5-Ex después de la agroinfiltración con 35S::ChiA1Ax o 35S::ChiA1Ex como control; barra de escala, 1 cm (d). Proporción de área amarilla de hojas de plantas IL5-Ex después de la agroinfiltración de 35S::ChiA1Ax, 35S::ChiA1Ex, 35S::GFP y tampón de infiltración vacío. Se utilizaron tres plantas individuales para cada tratamiento. Se utilizaron ChiA1Ex, GFP y tampón de infiltración como controles negativos. El fenotipo se analizó 2 semanas después de la infiltración. Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para los valores de P, consulte los datos fuente (e). f, Diagrama que muestra los productos proteicos predichos del gen ChiA1 en IL5-Ax, IL5-Ex y chia1-cas9-1. El cuadro rojo indica la secuencia de proteína no coincidente causada por el cambio de marco. Los números indican los sitios de aminoácidos. SP, péptido señal; GH18, dominio glicosil hidrolasa 18. g,h, fenotipo de la planta (g) y relación del área amarilla de la hoja (h) de chia1-cas9-1 en IL5-Ax (centro) en comparación con IL5-Ax (izquierda) e IL5-Ex (derecha). Para la relación de área amarilla foliar, se analizaron tres plantas individuales para cada genotipo. Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para los valores de P, consulte los datos fuente.

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La quitinasa A1 (ChiA1) es uno de los genes más expresados ​​en IL5-Ax (Tabla 1 y Datos ampliados, figura 4a) y está anotado como endoquitinasa bifuncional (Datos ampliados, figura 4b). La proteína codificada por ChiA1 es homóloga a AtLYS1/ChiA (AT5G24090), que tiene un papel central en el desencadenamiento de respuestas inmunes en Arabidopsis27 (Datos ampliados, figura 4c). Es importante destacar que ChiA1 porta una mutación sin sentido en P. exserta, que conduce a una proteína truncada de 158 aminoácidos (Datos ampliados, Fig. 4d, e). ChiA2 está estrechamente relacionado con ChiA1 pero muestra un nivel de expresión mucho más bajo que ChiA1 en IL5-Ax (Tabla 1). La monooxigenasa 1 que contiene flavina (FMO1) desempeña un papel clave en la resistencia sistémica adquirida al sintetizar N-OH-Pip a partir de ácido pipecólico34. Tiene dos copias en el genoma de P. exserta, mientras que solo una copia estaba presente en P. axillaris N. El canal iónico 1 activado por nucleótidos cíclicos (CNGC1) pertenece a una familia de genes implicados en la inmunidad de las plantas al desencadenar la señalización del calcio y la respuesta hipersensible35. 36.

Para validar funcionalmente estos cuatro candidatos para HNe2, reducimos sus niveles de transcripción en IL5-Ax mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS)37. VIGS de ChiA1 causó una fuerte disminución de la necrosis en plantas IL5-Ax en comparación con el vector vacío o los controles no tratados (Fig. 3b, c). Por el contrario, VIGS de ChiA2, FMO1 y CNGC1 no mostraron reducciones significativas de los síntomas (Fig. 3c). Para confirmar el papel de ChiA1 en HN, sobreexpresamos transitoriamente ChiA1Ax (alelo N de P. axillaris) así como ChiA1Ex (alelo P. exserta) en hojas de IL5-Ex impulsadas por el promotor 35S. ChiA1Ax se expresó altamente, mientras que ChiA1Ex fue apenas detectable (Datos ampliados, figura 4f). Solo las hojas que sobreexpresan ChiA1Ax se volvieron amarillas en la región de infiltración (Fig. 3d, e). Por lo tanto, la falta de acumulación de ARN mensajero es postranscripcional, probablemente debido a una desintegración mediada por sin sentido (NMD)38. Además, generamos un mutante de pérdida de función ChiA1 en el fondo de IL5-Ax mediante repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) –Cas9. El mutante (chia1-cas9-1) tiene una deleción de 4 pb, lo que provoca un cambio de marco y un codón de parada prematuro, lo que da como resultado una proteína truncada de 173 aminoácidos (en lugar de los 292 aminoácidos de longitud completa), similar a la proteína codificada. por ChiA1Ex (Fig. 3f). Los síntomas necróticos se redujeron fuertemente y la morfología de la planta fue similar a IL5-Ex (Fig. 3g, hy Datos ampliados Fig. 5a, b). Los resultados combinados demuestran más allá de toda duda razonable que ChiA1 es el gen subyacente a HNe2.

ChiA1 alberga el dominio glucósido hidrolasa 18 (GH18) y un péptido señal de secreción (Datos ampliados, figura 4b) y probablemente sea una enzima bifuncional que digiere tanto la quitina como el peptidoglicano como proteínas homólogas en el árbol del caucho (Hevea brasiliensis) y Arabidopsis27,39. Observamos que las actividades de quitinasa y lisozima eran extremadamente altas en las hojas de IL5-Ax en comparación con las otras líneas (Fig. 4a). En el mutante chia1-cas9-1, estas actividades se redujeron a un nivel similar al de IL5-Ex. Las plantas de P. axillaris N que sobreexpresan ChiA1 (35S :: ChiA1) mostraron niveles de actividad más altos en comparación con P. axillaris N de tipo salvaje. Además, las actividades enzimáticas estaban en línea con los niveles de transcripción de ChiA1 (Fig. 4b). Estos resultados indican que ChiA1 es responsable de las altas actividades de quitinasa y lisozima en las hojas de IL5-Ax.

a, Actividad quitinasa y lisozima en tejidos foliares de IL5-Ax, chia1-cas9-1 (IL5-Ax), IL5-Ex, P. axillaris N y línea de sobreexpresión de ChiA1 en el fondo de P. axillaris N (35S::ChiA1Ax). Para cada genotipo se utilizaron nueve plantas que se agruparon en tres para realizar réplicas. Se muestrearon sesenta y seis discos foliares de cada grupo para unificar el área foliar total utilizada. Los datos se presentan como media ± sd. Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey); IL5-Ax no se incluyó en la prueba ANOVA; para los valores de P, consulte los datos fuente. b, RT-PCR cuantitativa que muestra la transcripción de ChiA1 en hojas de IL5-Ax, chia1-cas9-1 (IL5-Ax), IL5-Ex, P. axillaris N y línea de sobreexpresión de ChiA1 de 12 semanas de edad en P. axillaris Fondo N (35S::ChiA1). Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas (n = 3). c, Fenotipos foliares representativos de plantas IL5-Ax e IL5-Ex en cultivo estéril. El fenotipo de las hojas se analizó 12 semanas después de la siembra. Se observaron cuatro plantas individuales de cada genotipo con resultados similares. Barra de escala, 1 cm. d, Análisis de la gravedad de la necrosis de hojas de plantas IL5-Ax e IL5-Ex de c. La proporción del área amarilla se basa en la proporción del área con color amarillo en comparación con el área foliar total. Un valor más alto indica una proporción de área amarilla mayor. n = 15 hojas para IL5-Ax y 16 hojas para IL5-Ex. (**P < 0,01, prueba t de Student bilateral, P = 0,0023). e, fenotipo representativo de hojas de IL5-Ex que sobreexpresan transitoriamente ChiA1D148A, E150A, ChiA1Ax, ChiA1Ex o GFP. Para la sobreexpresión se utilizó el promotor 35S. Se utilizaron hojas de plantas IL5-Ex de siete semanas de edad para la agroinfiltración. Las fotografías fueron tomadas 2 semanas después de la infiltración. Se utilizaron tres réplicas biológicas con resultados similares (Datos ampliados, figura 7b). Barra de escala, 1 cm. En el panel inferior se muestran esquemas de los productos proteicos de las variantes de ChiA1.

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A medida que ChiA1 degrada los componentes de la pared celular microbiana, nos preguntamos si los síntomas necróticos podrían ser causados ​​por productos de degradación conservados de las paredes celulares microbianas que podrían actuar como patrones moleculares asociados a microbios40. Cuando se cultivaron en condiciones axénicas, las plantas IL5-Ax aún desarrollaron fuertes síntomas necróticos (Fig. 4c, d; y Datos ampliados Fig. 6). Esto sugiere que los síntomas necróticos se desarrollan en ausencia de un sustrato microbiano para ChiA1. Para probar si el desarrollo de síntomas dependía de la actividad enzimática de ChiA1, generamos un mutante de ChiA1 en el que los aminoácidos críticos D148 y E150 en el motivo DXDXE del sitio activo de la glucósido hidrolasa se reemplazan por alanina (Fig. 4e). La mutación de estos dos aminoácidos suprime las actividades de quitinasa y lisozima41,42,43 (Datos ampliados, figura 7a). Las hojas de IL5-Ex que sobreexpresan ChiA1D148A, E150A o ChiA1Ax catalíticamente inactivos mostraron una fuerte necrosis en el sitio de infiltración, mientras que la sobreexpresión de ChiA1Ex y GFP no indujo síntomas (Fig. 4e y Datos ampliados Fig. 7b, c). Estos resultados muestran que los síntomas necróticos representan un caso de autoinmunidad que no depende de las actividades enzimáticas de ChiA1.

La reprogramación transcripcional es una parte integral de la inmunidad de las plantas44. Para comprender mejor el mecanismo subyacente a la activación del sistema inmunológico en IL5-Ax, seleccionamos los promotores de los 1.717 genes expresados ​​diferencialmente (DEG; q <0,001) entre IL5-Ax e IL5-Ex para elementos cis conservados (Tabla complementaria 5). Un sitio de unión WRKY (Fig. 5a) estuvo presente en el 60% de los promotores DEG (Tabla complementaria 6). Los factores de transcripción WRKY están involucrados en las respuestas a patógenos, respuestas al estrés abiótico y senescencia45,46. De todos los DEG que codifican los factores de transcripción WRKY, WRKY18 (homólogo de AtWRKY18) mostró el nivel de expresión más alto en IL5-Ax, mientras que su expresión fue insignificante en hojas de plantas de tipo salvaje IL5-Ex o P. axillaris N (Fig. 5b). Además, AtWRKY18 se une al motivo de unión típico en sus genes diana47 (Fig. 5a). La sobreexpresión de WRKY18 indujo síntomas necróticos en hojas de IL5-Ex y Nicotiana benthamiana (Fig. 5c, d). Es importante destacar que la agroinfiltración de 35S::ChiA1Ax pero no de 35S::ChiA1Ex en hojas de IL5-Ex indujo la expresión de WRKY18 (Figs. 5e y 3d y Datos ampliados Fig. 4f). Concluimos que la reprogramación transcripcional masiva observada en IL5-Ax está mediada por la inducción dependiente de ChiA1, muy probablemente indirectamente, de uno o más factores de transcripción de tipo WRKY18.

a, El elemento cis conservado que se encuentra en los promotores de los DEG entre los tejidos foliares de IL5-Ax e IL5-Ex. Para el análisis del elemento cis se utilizaron secuencias promotoras de una kilobase aguas arriba del codón de inicio de la traducción de los 1717 DEG. b, RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de transcripción de WRKY18 en hojas de plantas de P. axillaris N, IL5-Ax, IL5-Ex e IL5-Het. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba de diferencias honestamente significativas (HSD) de Tukey); para los valores de P, consulte los datos fuente. c, Imágenes representativas de hojas de IL5-Ex 2 semanas después de la agroinfiltración que llevan 35S::WRKY18, con 35S::GFP como control. Se observaron cinco réplicas biológicas con fenotipo similar. Los paneles de la derecha son los primeros planos de las regiones con marcos rojos. Barra de escala, 1 cm. d, Una imagen representativa de las hojas de tabaco (Nicotiana benthamiana) 5 días después de la agroinfiltración que llevan 35S::WRKY18, con 35S::GFP como control. Se observaron tres réplicas biológicas con fenotipo similar. Para la agroinfiltración se utilizaron hojas de tabaco de cinco semanas de edad. Los paneles de la derecha son los primeros planos de las regiones con marcos rojos. Barra de escala, 1 cm. e, RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de transcripción de WRKY18 en tejidos foliares que sobreexpresan ChiA1Ax o ChiA1Ex como se muestra en la figura 3d. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas (n = 3). ***P < 0,001; Prueba t de Student bilateral (P = 0,0000).

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ChiA1 se encuentra en el borde de una región del cromosoma 2, donde la recombinación en cruces entre P. axillaris N y P. exserta está fuertemente reducida19 (Fig. 6a). De hecho, ChiA1 está estrechamente vinculado (1,63 cM) a MYB-FL, un gen bien caracterizado dentro del supergén que es responsable de la ganancia y pérdida de la absorción floral de UV durante los cambios evolutivos en la preferencia de los polinizadores21 (Fig. 6a y Tabla complementaria 7). .

a, Una representación esquemática que muestra la región supergénica (de color amarillo) en el cromosoma 2 entre P. axillaris y P. exserta. La región supergénica se define desde EOBII hasta MYB3 como informaron anteriormente Hermann et al.19. b, Mapas de regiones de América del Sur que muestran los sitios (puntos negros) donde se recolectaron accesiones silvestres de P. axillaris (izquierda) y P. exserta (derecha). Las accesiones en una región cercana se agruparon para el cálculo de la frecuencia alélica (cuadrados sólidos negros o rojos). Las frecuencias de alelos regionales se muestran como minigráficos circulares cerca de los cuadrados. Las frecuencias alélicas generales de ChiA1Ax y ChiA1Ex en las dos colecciones se muestran en las esquinas inferiores izquierdas. El color amarillo indica el alelo ChiA1Ax. El color rojo indica el alelo ChiA1Ex. Las adhesiones cercanas a la región de Corrientes están encuadradas en rojo. El cuadrado discontinuo rojo comprende el hábitat de P. exserta, que se muestra ampliado a la derecha. Para obtener información detallada sobre los genotipos y la ubicación, consulte las Tablas complementarias 9 y 10. c, Esquema que muestra la interacción prevista de las barreras prezigóticas y postzigóticas entre P. axillaris y P. exserta. ChiA1 está estrechamente vinculado con varios genes que controlan los síndromes de polinización en el supergen. Los diferentes síndromes de polinización ayudaron a la especie a adaptarse a sus correspondientes polinizadores. La HN ayuda a fijar las combinaciones correctas de rasgos florales para su polinizador y, por tanto, mejora el aislamiento. d, Modelo del mecanismo molecular de HN. Izquierda: la interacción de P. axillaris ChiA1 de longitud completa y P. exserta HNe7 activa induce necrosis. Esta interacción se produce a través de un circuito de retroalimentación positiva que involucra el estrés del ER y los factores de transcripción WRKY. Medio: P. exserta truncado o chia1-cas9-1 ChiA1 no logra inducir P. exserta HNe7 activo porque el ARNm de ChiA1 no se acumula debido a la NMD. Derecha: P. axillaris ChiA1 de longitud completa no causa síntomas en combinación con P. exserta HNe7 inactiva.

El análisis de ChiA1 y sus genes vecinos mostró una clara microsintenia entre Petunia y las especies relacionadas de Solanaceae Solanum lycopersicum (tomate) y S. tuberosum (papa). Sin embargo, en ambas especies de Solanum, MYB-FL no está vinculado a ChiA1 sino que reside en un cromosoma diferente (Datos ampliados, figura 8 y tabla complementaria 8). El vínculo genético exclusivo entre ChiA1 y MYB-FL en Petunia es consistente con la noción de que la HN mediada por ChiA1 constituye una barrera poscigótica que actúa en conjunto con la barrera prezigótica para limitar el flujo de genes.

Para analizar las frecuencias de los dos alelos de ChiA1, genotipamos ChiA1 en todo el rango de las dos especies (para más detalles, consulte las Tablas complementarias 9 y 10). P. exserta fue muestreada en 18 sitios que representan su distribución altamente restringida en la Región de Guaritas de Brasil. De las 75 muestras de P. exserta genotipadas, 58 fueron homocigotas para la mutación sin sentido (ChiA1Ex), 13 fueron homocigotas para el genotipo de P. axillaris (ChiA1Ax) y 4 fueron heterocigotas (Fig. 6b, derecha, Datos ampliados, Fig. 9 y Suplementaria). Tabla 9). La frecuencia general del alelo ChiA1Ex entre estas muestras fue del 80% (Fig. 6b, derecha).

Se tomaron muestras de accesiones de P. axillaris en múltiples ubicaciones en Argentina, Uruguay y Brasil, incluidas las regiones de simpatría con P. exserta (Fig. 6b, izquierda, cuadrado con rayas rojas). De las 238 muestras de P. axillaris, 173 fueron homocigotas para el alelo de P. axillaris (ChiA1Ax), 61 fueron homocigotas para el alelo de P. exserta (ChiA1Ex) y 4 fueron heterocigotas (Fig. 6b, izquierda y Tabla complementaria 10). La frecuencia general del alelo ChiA1Ax entre estas muestras fue del 74% (Fig. 6b, izquierda). Sesenta y dos accesiones de P. axillaris con el alelo ChiA1Ex están ubicadas en las regiones de Corrientes y Entre Ríos en Argentina (Fig. 6b, cuadrado sólido en rojo), que está a ~500 km de la Región de Guaritas, donde las accesiones de P. exserta son exclusivamente encontró. Estas accesiones pertenecen a la subespecie parodii48 de P. axillaris, que se distingue de P. axillaris ssp. axillaris principalmente por su tubo de corola más largo49.

Estos resultados confirman la presencia de ambos alelos ChiA1 en las poblaciones naturales de P. axillaris y P. exserta. ChiA1Ex está más presente en P. exserta, mientras que ChiA1Ax es más frecuente en P. axillaris.

Descubrimos un caso de HN en cruces entre P. axillaris y P. exserta que se basa en una interacción epistática perjudicial entre los loci HNe2 y HNe7 (Fig. 6c). El gen subyacente a HNe2 es ChiA1, que codifica una proteína con actividad quitinasa y lisozima. El alelo ChiA1Ax codifica una enzima funcional, mientras que ChiA1Ex tiene una mutación sin sentido que conduce a un codón de parada prematuro.

Los casos de HN caracterizados en múltiples especies a menudo tienen puntos en común: activación de respuestas inmunes y participación directa de componentes del sistema inmunológico10. En un caso bien estudiado en tomate, una cisteína proteasa secretada causa autoinmunidad cuando el alelo de una especie silvestre relacionada está presente en combinación con un receptor de avirulencia (Avr) del tomate cultivado50,51. Sin embargo, en este ejemplo, se cree que la actividad proteasa de la enzima es esencial, mientras que el reemplazo de los aminoácidos críticos en el sitio activo de ChiA1 no interfiere con su capacidad para causar necrosis (Fig. 4e).

Si no es la actividad de la proteína, ¿por qué mecanismo ChiA1 causa necrosis? El nivel de expresión es alto para ChiA1Ax en IL5-Ax pero bajo para los alelos ChiA1Ex y chia1-cas9-1. La baja expresión de ChiA1Ex y chia1-cas9-1 probablemente se deba a la vía de vigilancia del ARNm a través de los mecanismos NMD del ARNm38. Por el contrario, ChiA1Ax es uno de los genes más expresados ​​en el fondo necrótico de IL5-Ax. La alta expresión de genes marcadores de estrés del RE en el mismo contexto indica estrés del RE. Muchas proteínas clave relacionadas con la patogénesis dependen del ER y del control de calidad del ER para el plegamiento y la secreción adecuados52,53,54. Proponemos que la demanda alta y crónica para el procesamiento de ChiA1 en la sala de emergencias excede la capacidad de trabajo del control de calidad de la sala de emergencias y causa estrés prolongado en la sala de emergencias y muerte celular55,56,57.

Teniendo en cuenta la expresión extremadamente alta de ChiA1Ax en la línea necrótica, parece plausible un circuito de retroalimentación positiva entre los dos loci que interactúan (Fig. 6d). La expresión basal de ChiA1Ax en la línea necrótica puede desencadenar la activación de HNe7Ex (probablemente a través de WRKY18) y, por lo tanto, HNe7Ex induce autoinmunidad, lo que mejora aún más la expresión de ChiA1. En este caso, HNe7 puede codificar un componente autoactivo del sistema inmunológico (por ejemplo, NLR10). Alternativamente, HNe7Ex activa la expresión de ChiA1Ax y ChiA1Ax induce la autoinmunidad. En ese caso, HNe7 podría ser un regulador transcripcional o postranscripcional. HNe7 está ubicado en una gran región de muy baja recombinación que contiene cerca de 1.000 genes y aún no se conoce su identidad. Por tanto, los detalles moleculares de la interacción de ChiA1 y HNe7 aún están por determinar.

Un aspecto único del trabajo presentado aquí es que ChiA1 está estrechamente vinculado a una región de baja recombinación que contiene genes importantes implicados en la evolución de los síndromes de polinización. Entre ellos se encuentra MYB-FL, que codifica un factor de transcripción que induce la síntesis de pigmentos que absorben los rayos UV en P. axillaris polinizado por polilla, pero que fue inactivado en P. exserta polinizado por colibrí19,21. Este vínculo genético es relativamente reciente, ya que ChiA1 y MYB-FL se encuentran en cromosomas diferentes en el tomate y la papa (Datos ampliados, figura 8). Esta asociación puede haber servido para mejorar el aislamiento reproductivo durante el proceso de especiación.

Tanto los alelos ChiA1Ax como ChiA1Ex se encontraron en P. axillaris así como en accesiones silvestres de P. exserta recolectadas en múltiples sitios en América del Sur (Fig. 6b). La presencia de ChiA1Ax en P. exserta silvestre podría deberse a introgresión58. P. axillaris ssp. parodii no llega hoy a la región de P. exserta, y en el pasado, no había condiciones adecuadas para P. parodii en la Serra do Sudeste, incluso considerando el Último Máximo Glacial (~ 22 kya) o el Holoceno medio (6 kya)59. La presencia de ChiA1Ex en P. axillaris ssp. parodii sugiere fuertemente una clasificación de linaje incompleta60, consistente con una función en aislamiento reproductivo durante la especiación. Como las quitinasas son importantes en la inmunidad activada por patrones contra patógenos, es probable que la pérdida de la función ChiA1 comprometa la defensa. El beneficio potencial del alelo ChiA1Ex en P. axillaris ssp. parodii necesitarán más estudios. La presencia de ChiA1Ax en P. exserta sugiere condiciones en las que los beneficios de la resistencia al patógeno superan su efecto sobre el aislamiento reproductivo.

La especiación ocurre cuando se acumulan barreras reproductivas y reducen sustancialmente el flujo de genes entre linajes3. La preferencia por los polinizadores es una fuerte barrera contra el flujo de genes, pero rara vez es absoluta61. Esto también es válido para Petunia62. Por lo tanto, a menudo se necesitan múltiples barreras reproductivas que actúen en conjunto para completar el aislamiento reproductivo63,64. El vínculo genético de distintos mecanismos de aislamiento mejoraría aún más el aislamiento reproductivo y, por lo tanto, aceleraría el ritmo de diversificación y especiación. Tal vinculación puede ser un fenómeno más general que puede ayudar a explicar la rápida y exitosa diversificación de las angiospermas.

P. axillaris N es del Jardín Botánico de Rostock (Alemania), P. exserta es de RJ Griesbach (Beltsville, Estados Unidos). Las accesiones se mantienen por autofecundación. La línea de introgresión IL5 ha sido descrita previamente28. Las accesiones silvestres de P. axillaris y P. exserta se han descrito previamente21,23,25,48 y se describen con más detalle en las Tablas complementarias 9 y 10.

Las plantas se cultivaron en un invernadero o en una cámara de crecimiento. Las plantas de invernadero se cultivaron con iluminación adicional, lo que dio como resultado 14 h al día a 18-25 °C en macetas. Las plantas cultivadas en una cámara de crecimiento están bajo un régimen de luz:oscuridad de 15 h:9 h, a 22 °C:17 °C a 60%–80% de humedad relativa, en suelo comercial (70% sustrato Klasman, 15% arcilla Seramis granulado y 15% arena de cuarzo) y fertilizado una vez por semana (Plantaktiv, fertilizante tipo K 16+6+26, concentración 0,1%).

La tinción con diaminobencidina (DAB) se realizó según un protocolo previo65. Después del tratamiento, la hoja se utilizó para observación inmediata o se mantuvo a 4 °C.

El ARN total se extrajo de los tejidos de las hojas utilizando un mini kit innuPREP DNA/RNA (Analytik Jena; código 845-KS-20800250). El ADN complementario se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc qScriber (HighQu; código RTK0104). Las reacciones de PCR cuantitativa se configuraron con ORA SEE qPCR Green ROX L Mix (HighQu; código QPD0505). La amplificación se realizó utilizando un instrumento de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Se tomaron muestras de hojas de tres plantas individuales para cada genotipo. Tomamos las séptimas hojas más viejas (contando de abajo hacia arriba; aproximadamente la sexta más nueva contando de arriba a abajo) de las plantas de 10 semanas, ya que esta hoja en las plantas IL5-Ax comienza a mostrar síntomas necróticos en esta etapa. Los datos fueron analizados mediante el método ∆∆Ct66 y normalizados mediante el gen housekeeping RAN121. Los pares de cebadores para PCR cuantitativa se enumeran en la Tabla complementaria 11.

La proporción del área amarilla de la hoja se calculó sobre la base de un método anterior con modificaciones67. Brevemente, se quitaron las hojas de cada planta y se fotografiaron sobre un fondo negro bajo condiciones de luz artificial uniforme con una tarjeta de referencia de color incluida en cada fotografía. Se utilizó el software Fiji (ImageJ) para procesar las imágenes68. El área foliar total, así como el área foliar amarilla y verde, se midieron sobre la base de umbrales de color para valores de tono, saturación y brillo. Sólo se compararon fotografías tomadas en la misma sesión para garantizar la uniformidad de la luz. Para definir los parámetros de tono que identifican una región como amarilla, primero aplicamos los parámetros a la tarjeta de referencia de color en cada fotografía y verificamos que las áreas amarillas identificadas fueran consistentes. El área amarilla medida en las tarjetas de colores se muestra en la Fig. 10 de datos ampliados. Luego utilizamos los umbrales de tono para analizar las fotografías de las hojas. La macro Fiji genera una versión pintada de las fotografías, donde se muestra el área amarilla medida. Verificamos manualmente que esta zona se superpusiera correctamente con las partes amarillas de las hojas. Puede encontrar scripts e instrucciones detalladas aquí: https://github.com/Kuhlemeier-lab/fiji_macros.

Utilizamos el método para BSR-seq (un análisis de segregación masiva basado en datos de RNA-seq) publicado por Soyk et al.69 para mapear los loci responsables de HN. Se utilizaron P. axillaris N (planta madre) y P. exserta (donante de polen) para producir una población F2. Se sembraron un total de 384 plantas F2 para el muestreo. Sobre la base de la escala fenotípica que se muestra en la Fig. 2a, seleccionamos plantas 13 semanas después de la siembra que mostraban un fenotipo de hoja necrótica fuerte (19 individuos, puntuación 4) o que mostraban un fenotipo de hoja sana (89 individuos, puntuación 0). Se recogió un disco de hoja (Ø = 9 mm) de una hoja madura y sana de cada planta, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. El ARN total se extrajo de conjuntos de discos foliares de plantas necróticas o de plantas sanas. NovoGene realizó RNA-seq con una preparación de biblioteca enriquecida con poliA, para obtener lecturas de extremos emparejados de 150 pb. La alineación de lecturas con control de calidad se realizó con STAR70 (2.6.0c) en el genoma de referencia de P. axillaris N versión 4.03. Las variantes se llamaron usando GATK71 (4.0.4.0). Las variantes se filtraron para mantener solo polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) bialélicos de alta calidad con una profundidad de lectura mínima de 100 en cada muestra (usando el argumento minDP en vcftools) y con un mínimo de 100 pb entre cada posición de variante. Calculamos la diferencia en la frecuencia de alelos alternativos entre los dos grupos (necrótico - sano) y utilizamos esta frecuencia ∆SNP para definir umbrales de todo el genoma en cuantiles de 0,01 y 0,05 (umbrales más bajos) y 0,95 y 0,99 (umbrales más altos). Luego, los SNP se agruparon en ventanas escalonadas de 100 SNP a lo largo del genoma y la proporción de SNP con valor fuera de los umbrales de todo el genoma en cada ventana se usó para producir la figura principal. Los cálculos y trazados de la frecuencia de alelos se realizaron en R72. Los parámetros detallados, las versiones de software y los scripts se encuentran depositados en Github: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#bsr-seq.

Como IL5-Het es una línea casi isogénica que segrega una región del cromosoma 2 que comprende HNe2 mientras que el resto del genoma es homocigótico, la utilizamos como material de partida para buscar líneas recombinantes entre sus progenies y reducir el tamaño del intervalo de interés. Seleccionamos 3800 progenies de IL5-Het con los marcadores mHIND-cn9140 y mHIND-MYB58 que flanquean la región heterocigótica, lo que permite la identificación de 37 líneas recombinantes (Tabla complementaria 1). Estas líneas albergan una región heterocigótica más pequeña en comparación con IL5-Het que se caracterizaron genotípicamente con la adición de más marcadores genéticos (Tablas complementarias 1 y 11). Luego, la caracterización fenotípica de las progenies homocigotas de estas líneas recombinantes permitió el mapeo fino de HNe2 hasta una región de 8,7 Mb (Tabla complementaria 1).

Para obtener una mejor resolución de los puntos de interrupción de la recombinación y reducir el locus HNe2, se seleccionaron diez líneas recombinantes informativas y cuatro controles homocigotos para la región HNe2 (dos P. axillaris y dos P. exserta) para la secuenciación del genoma completo (Tabla complementaria 1). La extracción de ADN genómico del tejido foliar de las líneas seleccionadas se realizó con un método CTAB modificado como se informó anteriormente73. El ADN se secuenció mediante la plataforma Next Generation Sequencing de la Universidad de Berna utilizando la preparación de la biblioteca de secuenciación del genoma completo Illumina para obtener lecturas de 150 pb de extremos emparejados. Las lecturas con control de calidad se alinearon con los parámetros predeterminados de BWA MEM74 con el genoma de P. axillaris N v. 4.03, proporcionando una cobertura promedio de 3,3 × a lo largo del genoma. Se llamaron variantes y se filtró la calidad con GATK71. La observación de los genotipos de las variantes asociadas al fenotipo HN en las líneas recombinantes permitió reducir el tamaño de la región que contiene HNe2. Las versiones detalladas del software, los parámetros y los scripts se encuentran depositados en Github: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#il-shallow-sequencing.

Se cultivaron plantas IL5-Ax e IL5-Ex procedentes del mismo progenitor IL5-Het para tomar muestras de hojas. Se cosechó la hoja que mostraba el inicio de la necrosis en IL5-Ax y se tomaron muestras de hojas equivalentes para los otros genotipos. Para cada genotipo se establecieron tres réplicas biológicas de tres plantas diferentes. El ARN total se extrajo de los tejidos de las hojas utilizando un mini kit innuPREP DNA/RNA (Analytik Jena; código: 845-KS-20800250). Los controles de calidad se realizaron utilizando un Nanodrop (NanoDrop 1000, Thermo Fisher) y un analizador de fragmentos (2100 Bioanalyzer Instrument, Agilent). RNA-seq fue realizado por Lausanne Genomic Technologies Facility (Universidad de Lausana) con la preparación de la biblioteca de ARN hebrado TruSeq para obtener lecturas de un solo extremo de 125 pb. Las lecturas con control de calidad se alinearon con el genoma de referencia de P. axillaris versión 4.03 utilizando STAR70. Los recuentos de lectura se generaron con Subread75. El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2 en R76 entre IL5-Ax e IL5-Ex (q <0,001). Las versiones detalladas del software, los parámetros y los scripts se encuentran depositados en Github: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#rnaseq.

ChiA1 y sus secuencias homólogas de las especies enumeradas en la figura 4c de datos extendidos se identificaron en la base de datos NCBI nr (secuencias de proteínas no redundantes) realizando una búsqueda BLASTp con secuencias de proteínas ChiA1 (Tabla complementaria 12). Las secuencias de aminoácidos se alinearon con MUSCLE en el paquete de software MEGA-X utilizando la configuración predeterminada para alineamientos múltiples de proteínas. Las distancias evolutivas se calcularon mediante análisis de corrección de Poisson. Se utilizó el método bootstrap con 1000 réplicas para las pruebas de filogenia.

AlphaFold77 predijo las estructuras de las variantes de ChiA1. Las estructuras fueron visualizadas y alineadas por PyMOL (Versión 2.5.3, Schrödinger LLC).

VIGS se realizó como se describió anteriormente23. Para cada gen candidato, nos dirigimos a una parte específica de la región codificante para evitar desviaciones (Tabla complementaria 11). Después de la amplificación con cebadores que contenían sitios de restricción BamHI y EcoRI, estos fragmentos se clonaron en el plásmido pTRV2-MCS (accesiones ABRC CD3-1040) y se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens. Siete semanas después de la infección, sólo se fenotiparon las hojas de las ramas que surgieron de meristemas infectados.

La secuencia codificante de ChiA1D148A, E150A se generó mediante el método de mutagénesis por PCR con ChiA1Ax como plantilla. Las secuencias codificantes de ChiA1Ax, ChiA1D148A, E150A y ChiA1Ex se amplificaron con cebadores que contenían sitios AttB (Tabla complementaria 11) y se clonaron en el vector binario pGWB402 compatible con Gateway (plásmido Addgene n.º 74796) que contiene un promotor CaMV35S. Para la sobreexpresión transitoria, las construcciones se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens. Las células de Agrobacterium se cultivaron hasta una DO600 de 0,8, se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de infiltración (sulfonato de éster metílico 10 mM, MgCl2 10 mM y acetosiringona 150 µM, pH 5,7) y se infiltraron en P. exserta de 7 u 8 semanas o 5 Hojas de la planta Nicotiana benthamiana de una semana de edad usando una jeringa sin aguja. El fenotipo se observó 2 semanas (Petunia) o 5 días (Nicotiana) después de la infiltración. Se generaron líneas N transgénicas estables de P. axillaris mediante transformación de discos foliares con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens siguiendo un protocolo adaptado23 basado en Conner et al.78.

La construcción CRISPR–Cas9 para ChiA1 pHSE401(Neo/Kana)-U6-26p > CHIAb[gRNA#1]-U6-26p>CHIAb[gRNA#2] se solicitó a VectorBuilder (https://en.vectorbuilder.com/) . ARNg 1: CTCACGTCCACTAGGAGATG, ARNg 2: AGGGAGGGACAGCAGAACAT. La construcción se transformó en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. La línea IL5-Ax CRISPR-Cas9 se generó con Agrobacterium mediante transformación de disco foliar siguiendo el mismo protocolo para líneas transgénicas estables de P. axillaris N. La edición en la generación T0 se detectó mediante PCR realizada en ADN genómico con cebadores dirigidos a los sitios de ARNg (Tabla complementaria 11) seguida de secuenciación de Sanger.

Las proteínas apoplásticas de las hojas se obtuvieron mediante infiltración al vacío de hojas de plantas de Petunia de 7 semanas de edad (la etapa en la que las plantas IL5-Ax comienzan a mostrar síntomas necróticos) con tampón de actividad del kit de ensayo de quitinasa (abbexa, catálogo: abx298854) o del kit de ensayo de actividad de lisozima. (Fluorométrico) (Abcam, catálogo: ab211113). Las hojas se secaron sobre una toalla de papel. Luego se obtuvieron discos de hojas (Ø = 9 mm) con una perforadora para poder determinar el área total de hojas utilizadas para la extracción de proteínas. Se combinaron veintidós discos de hojas de tres plantas como una réplica biológica. Posteriormente, los discos de hojas agrupados se colocaron en un tubo Falcon de 50 ml y se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos a 4 °C. Se establecieron tres réplicas biológicas (3 × 22 discos de hojas de nueve plantas) para cada genotipo analizado.

La actividad quitinasa se detectó con un kit de ensayo de quitinasa (abbexa, código: abx298854) siguiendo su protocolo estándar. Una unidad de actividad quitinasa se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µg de N-acetilglucosamina por hora a 37 °C. La actividad de la lisozima se detectó con el kit de ensayo de actividad de lisozima (fluorométrico) (Abcam, código: ab211113) siguiendo su protocolo estándar. Una unidad de actividad lisozima se definió como la cantidad de enzima que genera 1,0 μmol de 4-MU por minuto a pH 5,0 a 37 °C.

Como recipiente para el cultivo estéril se utilizaron vasos de precipitados transparentes de 5 litros. Los vasos con tierra comercial de 1,5 litros (70% sustrato Klasman, 15% gránulos de arcilla Seramis y 15% arena de cuarzo) se sellaron con papel de aluminio y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 min. Luego se agregaron 500 ml de agua esterilizada en autoclave al vaso de precipitados en un ambiente estéril bajo flujo laminar. Las semillas con el genotipo IL5-Ax e IL5-Ex se esterilizaron con lejía al 1% durante 10 minutos y se enjuagaron en agua esterilizada cinco veces. Luego las semillas se sembraron en los vasos de precipitados en un ambiente estéril. Los vasos se sellaron con varias capas de película plástica transparente y se colocaron en la cámara de crecimiento. Los fenotipos de las hojas se analizaron 12 semanas después de la siembra. Se observaron cuatro réplicas biológicas para cada genotipo con resultados similares.

Se extrajeron secuencias promotoras de un kilobase (1 kb aguas arriba de los codones de inicio de la traducción) de los DEG y se sometieron al descubrimiento del motivo mediante MEME-ChIP79 (//meme-suite.org/tools/meme-chip) con parámetros predeterminados.

Los genotipos de ChiA1 en las muestras silvestres de P. axillaris y P. exserta se determinaron mediante el marcador CAPS diseñado en el sitio de mutación sin sentido. La mutación G a T en el alelo ChiA1 de P. exserta altera el sitio de digestión de la enzima de restricción FokI (GGATGN7). Las secuencias del cebador del marcador CAPS se pueden encontrar en la Tabla complementaria 11. Los genotipos de MYB-FL se determinaron como se describió anteriormente21.

Las secuencias de MYB-FL, ChiA1 y sus cuatro genes cercanos en el genoma se sometieron a BLAST contra la biblioteca de ADNc ITAG Release 4.0 para S. lycopersicum y la biblioteca de ADNc PGSC DM4.03 para S. tuberosum. Para obtener identificaciones de genes detalladas y coordenadas de los genes que se muestran en el análisis de microsíntesis, consulte la Tabla complementaria 8.

Se utilizaron GraphPad Prism v.6.0.7 y Microsoft Excel 2016 para los análisis estadísticos (análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y prueba t de Student bilateral).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las lecturas de BSR-seq se han depositado en el Archivo de lectura de secuencias (SRA) del NCBI bajo BioProject PRJNA708139. Los datos de lecturas superficiales de secuenciación del genoma completo se han depositado en el BioProject PRJNA705072. Las lecturas de RNA-seq se han depositado en BioProject PRJNA705649. El conjunto del genoma de P. axillaris N 4.03 se ha depositado en NCBI GenBank con el número de acceso JANRMM000000000 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=JANRMM000000000).

Todos los scripts utilizados en este documento se han depositado en Github: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis. Los cálculos principales se realizaron en un clúster informático SLURM (UBELIX http://www.id.unibe.ch/hpc, el clúster HPC de la Universidad de Berna).

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Descargar referencias

Agradecemos a T. Nuernberger por la lectura crítica del manuscrito, a M. Chopy y D. Bonnet por su útil discusión y revisión, a T. Mandel y L. Lebeigle por su apoyo técnico y a C. Ball, J. Sekulovski y S. Dolder por su atención experta. de las plantas. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (31003A_182340 a CK) y la Unión Europea (ERC AdG 741354-RESPEC a CK).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Berna.

Vivien Pichon

Dirección actual: Departamento de Biología, Universidad de Friburgo, Friburgo, Suiza

Gina Cannarozzi

Dirección actual: Centro de Información sobre Química/Biología/Farmacia, ETH Zürich, Zürich, Suiza

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Mathieu Hanemian, Cris Kuhlemeier.

Instituto de Ciencias Vegetales, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Chaobin Li, Marta Binaghi, Vivien Pichon, Gina Cannarozzi, Mathieu Hanemian y Cris Kuhlemeier

Departamento de Genética, Laboratorio de Evolución Molecular, Universidad Federal de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil

Loreta Brandão de Freitas

Laboratorio de Interacciones Planta-Microbio-Medio Ambiente (LIPME), INRAE, CNRS, Universidad de Toulouse, Castanet-Tolosan, Francia

Mathieu Hanemian

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CK, MH y CL concibieron el estudio, diseñaron los experimentos y analizaron los datos. CL y MH realizaron experimentos relacionados con plantas. MB desarrolló los scripts y procesó los datos de secuenciación de alto rendimiento. VP realizó análisis de ROS y brindó soporte técnico. GC realizó modelado de estructuras de proteínas y ensamblaje del genoma. LBdF realizó trabajo de campo y aportó los materiales. CL y CK escribieron el artículo con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a Mathieu Hanemian o Cris Kuhlemeier.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Elena Kramer y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Fenotipo vegetal de IL5-Ax e IL5-Ex en diferentes días después de la siembra (DAS). b, Evaluación de la producción de ROS mediante tinción con DAB de una planta IL5-Ex representativa de 5 semanas. El DAB se oxidó con peróxido de hidrógeno (ROS) y se tiñó de marrón. El experimento se repitió una vez con resultados similares (n = 2). c, RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de expresión de los genes relacionados con la patogénesis PR1, PR1B1 y PTI5 en hojas de plantas de P. axillaris N, IL5-Ax, IL5-Ex e IL5-Het de 10 semanas de edad. Los datos se presentan como valores medios ± sd de tres réplicas biológicas (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); Para los valores de P, consulte Datos de origen. d, RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de expresión de los genes marcadores de estrés ER BiP4, BiP5 y bZIP60 en hojas de plantas de P. axillaris N, IL5-Ax, IL5-Ex e IL5-Het de 10 semanas de edad. Los datos se presentan como valores medios ± sd de tres réplicas biológicas (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para valores de P, consulte Datos de origen.

Datos fuente

Los puntos representan la diferencia de frecuencia entre los grupos para cada SNP. Un valor de y superior a 0 indica una mayor frecuencia del alelo de P. exserta en el grupo necrótico. Esta tendencia se observa en gran parte de Chr 7. Un valor de y inferior a 0 indica una mayor frecuencia del alelo N de P. axillaris en el grupo necrótico. Esta tendencia se observa en gran parte de Chr 2. Las líneas azules representan el suavizado de Loess, con intervalos de confianza de 0,95 representados en gris claro. Las líneas discontinuas indican el valor cuantil de todo el genoma de 0,01 y 0,99, mientras que las líneas de puntos indican el valor cuantil de 0,05 y 0,95.

Esquema que muestra los genotipos de los marcadores SNP más informativos obtenidos de la secuenciación superficial de diez líneas recombinantes informativas (Fig. 3a y Tabla complementaria 1). El color rojo indica que el genotipo de la muestra en el SNP especificado es homocigótico para P. exserta; El color amarillo indica que el genotipo de una muestra en el SNP especificado es homocigótico para P. axillaris N. El marco negro indica la región asociada con el fenotipo HN en el mapeo fino.

a, RT-PCR cuantitativa que muestra la transcripción de ChiA1 en P. axillaris N, IL5-Ax. Hojas de IL5-Ex e IL5-Het. Los datos se presentan como valores medios ± sd de tres réplicas biológicas (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para valores de P, consulte Datos de origen. b, Anotación de dominio de ChiA1 que sugiere que es una quitinasa bifuncional glucósido hidrolasa (GH18) con un péptido señal de secreción (SP). c, Relaciones filogenéticas de ChiA1 y sus homólogos en algunas otras especies. Las distancias se estimaron utilizando el algoritmo de unión de vecinos. Los números en los nodos representan su nivel de confianza, mostrado como un porcentaje de 1000 bootstraps. La barra de escala indica el número promedio de sustituciones de aminoácidos por sitio. El homólogo de Arabidopsis thaliana se utilizó como grupo externo. d, Mutación sin sentido en el alelo ChiA1 P. exserta. El panel superior muestra la representación esquemática de ChiA1 con la mutación sin sentido G a T. El sitio mutado está indicado por un triángulo. La línea delgada indica el intrón. Los cuadros negros indican los exones. Los cuadros blancos indican las regiones no traducidas. El panel inferior muestra la secuenciación de Sanger que confirma la mutación G a T de ChiA1 en P. exserta. El asterisco indica el codón de parada de la traducción. e, Modelos de estructura de ChiA1Ax y ChiA1Ex predichos por AlphaFold. Para la predicción de la estructura se utilizan secuencias de proteínas de ChiA1Ax y ChiA1Ex. f, Cuantificación de los niveles de expresión de ChiA1 en hojas de plantas IL5-Ex que sobreexpresan transitoriamente ChiA1Ax, ChiA1Ex, GFP o controles negativos. Los datos se presentan como valores medios ± sd (n = 9 hojas para cada tratamiento). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para valores de P, consulte Datos de origen.

Datos fuente

a, Fenotipo vegetal de chia1-cas9-1 en IL5-Ax en comparación con IL5-Ax e IL5-Ex en diferentes semanas después de la siembra. b, Fenotipo de hoja de chia1-cas9-1 en IL5-Ax en comparación con IL5-Ax e IL5-Ex. El fenotipo de la hoja fue fotografiado a las 13 semanas después de la siembra. Barra de 1 cm.

Cultivo estéril de IL5-Ax e IL5-Ex en un vaso de precipitados transparente sellado (izquierda) y una hoja representativa de cada una de las plantas IL5-Ex e IL5-Ax en cultivo estéril (derecha). Barra de 1 cm.

a. Actividad quitinasa y lisozima en tejidos de hojas que sobreexpresan transitoriamente ChiA1Ax, ChiA1Ex o ChiA1D148A, E150A en un fondo de IL5-Ex de 7 semanas, con la sobreexpresión de GFP, tampón de infiltración u hojas de plantas no tratadas como controles. Para cada genotipo se utilizaron 9 plantas que se agruparon en 3 para las réplicas. Se muestrearon sesenta y seis discos foliares de cada grupo para unificar el área foliar total utilizada. Los datos se presentan como valores medios ± sd. Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para valores de P, consulte Datos de origen. b, El fenotipo de IL5-Ex deja sobreexpresar transitoriamente ChiA1D148A, E150A, ChiA1Ax, ChiA1Ex y GFP con tres réplicas biológicas. Para la sobreexpresión se utilizó el promotor 35S. Se utilizaron ChiA1Ex y GFP como controles. Se utilizaron hojas de plantas IL5-Ex de 7 u 8 semanas de edad para la agroinfiltración. Las fotografías fueron tomadas 2 semanas después de la infiltración. Barra de 1 cm. C. Cuantificación de los niveles de expresión de ChiA1 en hojas de plantas IL5-Ex que sobreexpresan transitoriamente ChiA1Ax, ChiA1Ex, ChiA1D148A, E150A, GFP o controles negativos. Los datos se presentan como valores medios ± sd (n = 4 hojas para cada tratamiento). Letras diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba HSD de Tukey); para valores de P, consulte Datos de origen.

Datos fuente

Las secuencias genómicas de ChiA1 y sus cuatro genes cercanos, así como el gen MYB-FL, se utilizaron para una búsqueda BLAST de los genomas de P. axillaris N, S. lycopersicum y S. tuberosum. Los números de acceso de genes, las coordenadas y las versiones del genoma detallados se pueden encontrar en la Tabla complementaria 8 y en la sección Métodos.

La región del cuadrado rojo se amplió en el panel derecho. La frecuencia de sus alelos regionales se muestra como un gráfico circular en la esquina superior izquierda. El color amarillo indica el alelo ChiA1Ax. El color rojo indica el alelo ChiA1Ex. Para obtener información detallada sobre los genotipos y la ubicación, consulte la Tabla complementaria 9.

La consistencia de las áreas amarillas identificadas en cada conjunto de imágenes de la Fig. 3c (a), 3e (b), 3h (c), 4d (d) se validó utilizando la tarjeta de colores incluida en cada imagen.

Tabla complementaria 1. Mapeo fino de HNe2 utilizando líneas recombinantes derivadas de IL5-Het. Tabla complementaria 2. Lista de genes dentro de la región final HNe2. Tabla complementaria 3. Nivel de expresión (recuentos de lectura normalizados) de los genes presentes en la región HNe2. Tabla complementaria 4. Características de los 34 genes expresados ​​presentes en la región HNe2. Tabla complementaria 5. Lista de todos los genes expresados ​​diferencialmente entre hojas de plantas IL5-Ax e IL5-Ex. Tabla complementaria 6. Lista de DEG entre las hojas de IL5-Ax e IL5-Ex que portan un sitio o sitios de unión WRKY que se muestran en la Fig. 5a en las regiones promotoras. Tabla complementaria 7. Distancia genética entre ChiA1 y MYB-FL analizada por una población F2 de 369 individuos. Tabla complementaria 8. ID de gen y coordenadas de los genes utilizados en el análisis de microsíntesis. Tabla complementaria 9. Información detallada de los individuos en las accesiones silvestres de P. exserta. Tabla complementaria 10. Información detallada de individuos en las accesiones silvestres de P. axillaris. Tabla complementaria 11. Lista de cebadores. Tabla complementaria 12. ID y secuencias de proteínas utilizadas en el análisis filogenético de ChiA1.

Datos de fuente estadística.

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Reimpresiones y permisos

Li, C., Binaghi, M., Pichon, V. et al. Estrecho vínculo genético de genes que causan necrosis híbrida y aislamiento de polinizadores entre especies jóvenes. Nat. Plantas 9, 420–432 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01354-8

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Recibido: 01 de septiembre de 2022

Aceptado: 19 de enero de 2023

Publicado: 20 de febrero de 2023

Fecha de emisión: marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01354-8

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