Preparación de hidrogeles multifuncionales con grupos isotiouronio accesibles mediante cruce de radicales.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10361 (2023) Citar este artículo

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Los hidrogeles pueden equiparse con grupos funcionales para fines específicos. Los grupos de isotiouronio pueden mejorar la adsortividad o permitir el acoplamiento de otros grupos funcionales mediante reacciones leves después de la transformación en grupos tiol. Aquí presentamos un método para preparar hidrogeles multifuncionales mediante la introducción de grupos de isotiouronio en hidrogeles de diacrilato de poli (etilenglicol) (PEGDA) y convertirlos en hidrogeles funcionalizados con tiol mediante la reducción de los grupos de isotiouronio. Para ello, se sintetizó y copolimerizó con PEGDA el monómero anfifílico bromuro de 2-(11-(acriloiloxi)-undecil)isotiouronio (AUITB), que contiene un grupo isotiouronio. De esta manera conveniente, fue posible incorporar hasta un 3% en peso de AUITB en los hidrogeles sin cambiar su grado de hinchamiento en equilibrio. La funcionalización exitosa se demostró mediante el análisis de la superficie de los hidrogeles con mediciones del ángulo de contacto con el agua y el aumento de los puntos isoeléctricos de las superficies del hidrogel de 4,5 a 9,0 debido a la presencia de grupos de isotiouronio. Los hidrogeles mostraron idoneidad como adsorbentes, como lo demuestra la pronunciada adsorción del fármaco aniónico diclofenaco. El potencial de la funcionalización para reacciones de (bio)conjugación quedó demostrado mediante la reducción de grupos de isotiouronio a tioles y la posterior inmovilización de la enzima funcional peroxidasa de rábano picante en los hidrogeles. Los resultados muestran que se pueden introducir grupos de isotiouronio totalmente accesibles en hidrogeles reticulados por radicales.

Los hidrogeles se examinan exhaustivamente en los campos de la ingeniería de tejidos1,2,3, la administración de fármacos4,5,6 o los (bio)sensores7,8,9. Están compuestos por una red polimérica insoluble que se hincha en un medio acuoso10. La funcionalidad del hidrogel, al igual que su comportamiento de hinchamiento, generalmente resulta de una interacción entre la red polimérica y el medio de hinchamiento11,12,13. Sin embargo, una forma elegante de adaptar las propiedades del hidrogel es cambiando la composición de la red del polímero o la densidad y arquitectura de los enlaces cruzados.

Una clase destacada de hidrogeles se basa en poli(etilenglicol) (PEG), a menudo preparado mediante fotocurado de diacrilato de PEG (PEGDA)5,14,15,16. Los hidrogeles resultantes son bioinertes e inhiben la adsorción de proteínas17,18 así como la adhesión celular19,20. Según los requisitos de las propiedades del hidrogel, la formación de la red polimérica puede verse influenciada por la masa molar o la concentración de PEGDA en las soluciones precursoras del hidrogel, es decir, antes de la reticulación21,22,23. Además, se puede lograr una funcionalización de hidrogeles basados ​​en PEG agregando otras moléculas o monómeros a las soluciones precursoras de hidrogel. Esto se hizo con éxito antes, por ejemplo, incluyendo monómeros que generaban un hidrogel de polielectrolito15,16,24. El monómero cargado positivamente cloruro de 2-(metacriloiloxi)etil trimetilamonio (MAETAC) se incorporó a hidrogeles de PEGDA mediante copolimerización15. En un estudio similar, se utilizó el monómero metalilsulfonato de sodio (SMAS) cargado negativamente para funcionalizar hidrogeles de PEGDA16. En ambos estudios, se observó una mayor adsorción de proteínas, adhesión celular y proliferación en los hidrogeles funcionalizados en comparación con los hidrogeles no funcionalizados. Además de mejorar la compatibilidad celular, estos hidrogeles de polielectrolitos tienen otras ventajas y posibles aplicaciones. Los materiales polielectrolíticos se pueden utilizar para adsorber moléculas de carga opuesta mediante interacción electrostática o intercambio iónico y se pueden aplicar, por ejemplo, en la purificación de agua25. La elección del monómero y su grupo funcional es crucial para el posible campo de aplicación del hidrogel.

Un resto iónico particularmente interesante, que hasta ahora se ha descuidado para la preparación de hidrogeles macroscópicos, es el grupo isotiouronio. Anteriormente se informaron propiedades notables de las sales de isotiouronio de baja masa molar o de las nanopartículas que contienen isotiouronio, como la actividad antitumoral26 o los efectos antibacterianos27. Las partículas con funcionalidad isotiouronio están disponibles comercialmente como adsorbentes de iones de metales pesados28,29,30,31. El grupo isotiouronio es estable en ambientes acuosos de ácidos a neutros y en contacto con el aire y, por lo tanto, podría ser adecuado para agregarlo directamente a soluciones precursoras de hidrogel.

Además de los efectos directos de los grupos isotiouronio, sus propiedades químicas facilitan otra posibilidad: se hidrolizan eficientemente para producir tioles bajo la acción del hidróxido de sodio o del metabisulfito de sodio32,33. Por tanto, los grupos isotiouronio pueden considerarse precursores de tiol sintéticos. Esto es de particular relevancia porque a menudo resulta difícil introducir tioles directamente en los hidrogeles porque interfieren con reacciones de reticulación típicas, por ejemplo, la polimerización radical34,35 o son un reactivo en la reacción de reticulación mediante la cual se consumen, por ejemplo, en polímeros. reticulación mediante reacciones de adición de tiol-ino o de tipo Michael36,37. Por lo tanto, el camino que utiliza grupos de isotiouronio como tioles protegidos durante la reticulación podría ofrecer una oportunidad elegante para liberar tioles mediante reacciones posteriores a la polimerización después del curado.

La alta reactividad de los tioles ofrece la oportunidad de unirse covalentemente a otras moléculas e incluso utilizarlos para reacciones de bioconjugación en ambiente acuoso38. Sin embargo, sólo unos pocos estudios informan sobre la disponibilidad de tioles en hidrogeles. El grupo de Sajeesh et al. prepararon micropartículas de hidrogel a base de ácido polimetacrílico, polietilenglicol y quitosano con funcionalidad tiol para la administración oral de insulina39. Southan et al. sintetizaron polímeros con una estructura principal de PEG y poli (glicidiltiol) copolimerizado con PEGDA para generar hidrogeles a base de PEG con funcionalidad tiol, lo que aumentó la adhesividad celular de los hidrogeles a los fibroblastos en comparación con los hidrogeles de PEGDA no modificados19. En otro estudio, se recubrieron hidrogeles a base de PEG con nanopartículas de oro mediante impresión reactiva por microcontacto40. Debido a las interacciones de los tioles y el oro, las nanopartículas de oro se transfirieron más fácilmente a hidrogeles de PEG funcionalizados con tiol y las células de fibroblastos murinos L929 prefirieron adherirse a la capa de nanopartículas. Cai et al. preparó hidrogeles de PEG mediante la adición de tiol-ino nucleofílico con PEG-alquinos de 4 brazos y PEG-tioles36. Determinaron tioles residuales en los hidrogeles reticulados, por lo que debía haber alquinos libres. Y utilizaron los alquinos libres para unir un tinte que contenía tiol, así como un péptido antimicrobiano, pero no utilizaron los tioles en el hidrogel.

En este artículo, abordamos la hipótesis de si el monómero bromuro de 2-(11-(acriloiloxi)-undecil)isotiouronio (AUITB) recientemente sintetizado que porta un grupo funcional isotiouronio se puede utilizar en la formación de redes poliméricas mediante reticulación radical. de PEGDA, y generar así hidrogeles funcionales de isotiouronio. Luego, nuestro objetivo es investigar las propiedades superficiales y masivas de los hidrogeles funcionales de isotiouronio que hipotéticamente pueden generarse en este proceso, incluida la prueba de su utilidad como adsorbentes o materiales antimicrobianos. Además, nos gustaría seguir la hipótesis de que los hidrogeles con funcionalidad isotiouronio se pueden usar para generar grupos tiol accesibles en los hidrogeles que exhiben reactividad en la reacción tiol-Michael. Finalmente, investigaríamos si los tioles así introducidos pueden usarse para inmovilizar covalentemente una enzima en los hidrogeles manteniendo su actividad.

Los siguientes productos químicos se adquirieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania): solución de sustrato líquido de 2,2´-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), hidróxido de amonio (NH4OH) ~ 28–30 % de base NH3 , cloruro de acriloilo ≥ 97%, cloroformo deuterado (CDCl3) 99,8%, diyodometano 99%, etanol (EtOH) absoluto para análisis, peróxido de hidrógeno (H2O2) 30%, hidroquinona, 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)- 2-metilpropiofenona (Irgacure 2959), diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA) Mn ~ 700 g mol-1, hidróxido de sodio (NaOH), metabisulfito de sodio (Na2S2O5), cloruro de potasio (KCl) para análisis, trietilamina (TEA) ≥ 99,5%, y ácido trifluoroacético (TFA), para HPLC ≥ 99%. El cloroformo ≥ 99,8 % y el diclorometano (DCM) ≥ 99,8 % se adquirieron en Honeywell (Offenbach, Alemania). La acetona técnica y el isopropanol se adquirieron en Brenntag GmbH (Essen, Alemania). El dimetilsulfóxido (DMSO) para síntesis y el tetrahidrofurano (THF) para HPLC se adquirieron de ChemSolute® (Th.Geyer, Renningen, Alemania). El 11-bromo-1-undecanol y la sal sódica de diclofenaco (DSS) ≥ 98,0 % se adquirieron de TCI GmbH (Eschborn, Alemania). Acetonitrilo, grado de gradiente de HPLC ROTISOLV®, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio y triptona se adquirieron de Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Alemania). El etilenglicol al 99 % y la tiourea se adquirieron de Alfa Aesar (Kandel, Alemania). EZ-Link ™ maleimida-PEG11-biotina y extracto de levadura (Gibco) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Dreieich, Alemania). Se compraron otros reactivos de las siguientes empresas (entre paréntesis): maleimida Atto488 (Atto-TEC GmbH, Siegen, Alemania), agar BD Bacto (BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Alemania), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) 99,8 % (Deutero, Kastellaun, Alemania), acetato de etilo para HPLC (VWR Chemicals, Darmstadt, Alemania), ácido clorhídrico (HCl) 37% (Häberle Labortechnik GmbH & Co, Lonsee-Ettlenschieß, Alemania), sulfato de magnesio 99% anhidro (abcr GmbH, Karlsruhe, Alemania), gas nitrógeno (Air Liquide, Düsseldorf, Alemania), hidróxido de potasio (KOH) (AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania), poliperoxidasa de rábano picante acoplada a estreptavidina (SA-HRP, reactivos SDT, Baesweiler, Alemania) . Se preparó recientemente solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) con NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM y Na2HPO4 · 2 H2O 8,1 mM en agua desionizada. El cloruro de acriloilo se destiló antes de su uso. El agar caldo de lisogenia (LB) se preparó con 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1 de extracto de levadura, 10 g L-1 de NaCl y 15 g L-1 de agar. El pH se ajustó a 7,0 con NaOH 1 N y posteriormente el agar LB se esterilizó en autoclave. El medio LB se preparó con 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1 de extracto de levadura y 10 g L-1 de NaCl. El pH se ajustó a 7,0 con NaOH 1 N y posteriormente el medio LB se esterilizó en autoclave.

Se disolvieron 5,00 g (19,9 mmol, 1,0 eq.) de 11-bromo-1-undecanol en 70 ml de tetrahidrofurano (THF) y se enfriaron en un baño de hielo. Se añadieron 3,33 ml (23,9 mmol, 1,2 eq.) de trietilamina. En atmósfera de argón, se disolvieron 1,93 ml (23,9 mmol, 1,2 eq.) de cloruro de acriloilo en 30 ml de THF y se añadieron gota a gota al matraz (aproximadamente 1 gota/3 s). La mezcla de reacción se volvió opaca y se agitó a temperatura ambiente durante 40 h. La mezcla se filtró y se eliminó el THF a presión reducida a 160 mbar y 25ºC. Se añadieron 50 ml de diclorometano (DCM) y la fase orgánica se extrajo con 50 ml de una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 2% p/v. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y el disolvente se eliminó a presión reducida de 400 mbar a 25 °C. El producto (pasta de color beige a amarillo) se secó al vacío durante 2,5 h. Además del acrilato de 11-bromondecilo, también se generó acrilato de 11-hidroxilundecilo. Dado que este último no puede reaccionar en el segundo paso, no se realizó ninguna purificación adicional. El 82% de la mezcla de productos (2,85 g) consistía en acrilato de 11-bromondecilo con un rendimiento del 38%.

RMN 1H de acrilato de 11-bromondecilo (500 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 1,35 (m, 14 H), 1,62–1,70 (m, 2 H), 1,80–1,89 (m, 2 H), 3,40 (t , J = 6,9 Hz, 2 H), 4,14 (t, J = 6,8 Hz, 2 H), 5,81 (dd, J = 10,4, 1,4 Hz, 1 H), 6,12 (dd, J = 17,3, 10,4 Hz, 1 H), 6,39 (dd, J = 17,3, 1,4 Hz, 1 H). El espectro de 1H NMR se muestra en la Figura SI 1.

Se disolvieron 2,71 g de la mezcla de productos de la reacción anterior, que contenía 2,22 g (7,3 mmol, 1,0 eq.) de acrilato de 11-bromondecilo, en 44 ml de EtOH. Se añadieron una solución de 0,024 g (0,2 mmol, 0,03 eq.) de hidroquinona en 11 ml de etanol y una solución de 0,75 g (9,8 mmol, 1,35 eq.) de tiourea en 123 ml de etanol. La mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. El EtOH se eliminó a presión reducida a 100 mbar y 40 °C. La mezcla se lavó con cloroformo (CHCl3) y se filtró. Se eliminó el CHCl3 a presión reducida de 370 mbar a 40 °C y el residuo se secó al vacío. Se añadió acetato de etilo para precipitar el producto (sólido blanco) y se eliminó por filtración. AUITB se secó al vacío durante la noche y se obtuvo con un rendimiento del 36 %.

RMN 1H de AUITB (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,13–1,43 (m, 14 H), 1,50–1,65 (m, 4 H), 3,13 (t, J = 7,3 Hz, 2 H) , 4,09 (t, J = 6,6 Hz, 2 H), 5,93 (dd, J = 10,3, 1,6 Hz, 1 H), 6,16 (dd, J = 17,3, 10,3 Hz, 1 H), 6,31 (dd, J = 17,3, 1,6 Hz, 1 H), 8,99 (s, 4 H).

RMN 13C de AUITB (126 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 25,35, 27,77, 28,08, 28,34, 28,37, 28,62, 28,83, 28,86, 28,87, 30,11, 64,07, 128,41, 131,36 , 165,52, 169,93. Los espectros de RMN se muestran en la Figura SI 2 y la Figura SI 3.

Análisis elemental (%) calculado para AUITB: C 47,24, H 7,66, N 7,35, S 8,41, Br 20,95, O 8,39; encontrado C 47,37, H 7,69, N 7,43, S 8,34, Br 20,75.

Espectros Raman de AUITB: \(\nu\) [cm−1] = 2846 (CH), 1714 (éster α,β-insaturado), 1637 (NH2 o C = C).

Se prepararon muestras de diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA) mediante reticulación radical con el fotoiniciador Irgacure 2959. Para muestras de PEGDA sin AUITB (PEGDA-0), se preparó una solución precursora de 0,5% en peso de Irgacure 2959 y 99,5% en peso de PEGDA. y se mezcló durante la noche bajo la protección de la luz. Para las muestras funcionalizadas, se disolvieron entre 0,1% en peso y 3% en peso de AUITB en PEGDA y, si era necesario para facilitar la disolución, se realizó un calentamiento adicional a 80 °C, seguido de un enfriamiento a temperatura ambiente. Esto dio como resultado una relación molar de AUITB y PEGDA entre 0,18% y 5,7%. Posteriormente, se añadió Irgacure 2959 hasta una concentración final de 0,5% en peso y se disolvió durante la noche bajo la protección de la luz. La composición de todas las soluciones precursoras de hidrogel se enumera en la Tabla SI 1. Las muestras que contienen AUITB se denominan PEGDA-0.1, PEGDA-0.5, PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA-3, el número significa la fracción de masa de AUITB. βAUITB en las soluciones precursoras. Las obleas de silicio se limpiaron con acetona, isopropanol y agua desionizada y se secaron con gas nitrógeno después de cada paso de limpieza. Posteriormente, las obleas limpias se activaron con peróxido de hidrógeno e hidróxido de amonio en una proporción de volumen de 2:3 a 70 °C durante 40 min. Después de enfriar hasta temperatura ambiente (TA), las obleas se enjuagaron con agua desionizada y se secaron con gas nitrógeno. Los paneles de vidrio de cuarzo se enjuagaron con acetona y agua desionizada. Las obleas de silicio activado se transfirieron a moldes de aluminio para una mejor estabilidad y se colocaron marcos de silicona (altura 500 µm) encima. La solución de PEGDA se vertió dentro del marco y el molde se cerró con el panel de vidrio de cuarzo. La solución se entrecruzó con luz UV durante 7,5 minutos después de un período de espera de 5 h bajo la protección de la luz (intensidad de radiación de 50 mW cm-2, rango espectral > 300 nm, con un máximo de emisión alrededor de aproximadamente 365 nm). , sol2, Dr. Hönle AG). Para el análisis de superficie se investigó siempre la superficie del hidrogel orientada hacia las obleas de silicio activadas. Para las mediciones de adsorción, las soluciones precursoras se prepararon como se describió anteriormente con 0,5% en peso de Irgacure 2959, βAUITB entre 1% en peso y 3% en peso, y entre 98,5% en peso y 96,5% en peso de PEGDA (Tabla SI 1). Después de mezclar, la solución de PEGDA se vertió en un molde cilíndrico de aluminio (diámetro 30 mm, altura 1 mm), se cubrió con una hoja de vidrio de cuarzo y posteriormente se reticuló con irradiación UV durante 7,5 minutos. Antes de experimentos posteriores con las muestras, se lavaron excesivamente y se hincharon como se explica en las secciones respectivas a continuación.

Se registraron espectros Raman (microscopio Raman inVia™, Qontor®, Renishaw plc) de AUITB, PEGDA sin reaccionar, una muestra de PEGDA-0 y una muestra de PEGDA-3 para evaluar si el monómero interfería con el proceso de reticulación de PEGDA y si fuera posible detectar los grupos de isotiouronio de AUITB. Las muestras se midieron después de hincharse en agua durante 72 h y secarse a presión reducida de aprox. 50 mbar durante 24 h a 60 °C (VDL 53, Binder GmbH). Para registrar los espectros se utilizó un láser de 532 nm y el objetivo Leica 50x/0,5/8,2 mm. Las correcciones de referencia de los espectros se realizaron con una versión autoimplementada de un algoritmo de ajuste polinomial modificado según Lieber & Mahadevan-Jansen en el rango de números de onda de 700 a 3700 cm-1 (Python 3.8, Anaconda 3)41. Todos los espectros se normalizaron y los máximos de las bandas se identificaron con OriginPro 2019b de OriginLab.

Para determinar el grado de hinchamiento en equilibrio (EDS) y el rendimiento del gel (Yg), se perforaron muestras rectangulares del tamaño de 1 cm x 2 cm después de la reticulación. La EDS se calculó con la siguiente ecuación:

mswollen es la masa de los hidrogeles después de hincharse en agua durante 72 h, reemplazando el agua cada 24 h, y mdry es la masa de las muestras después de secarse a presión reducida de aprox. 50 mbar a 60 °C durante 24 h (VDL 53, Binder GmbH).

El rendimiento del gel (Yg) se determinó como sigue:

Aquí, mpol es la masa de las muestras inmediatamente después de la reticulación.

Para estimar el tamaño de malla de las muestras de PEGDA-0, primero se calculó la fracción de volumen del polímero de equilibrio ϕ de los hidrogeles mediante:

En esta ecuación, Vdry es el volumen del hidrogel seco, Vswollen es el volumen del hidrogel hinchado, ρPEGDA es la densidad de PEGDA (1,12 g cm-3)42 y ρH20 es la densidad del agua que se supuso que era 1,0 g. cm-3. A partir de ϕ, la masa molar Mc entre los enlaces cruzados de las redes de hidrogel se estimó utilizando la ecuación de Flory-Rehner 43,44:

Aquí, Mn es la masa molar promedio en número de los polímeros PEGDA antes de la reticulación, χ = 0,426 es el parámetro de interacción Flory-Huggins de PEGDA con agua45, M1 = 18,01 g mol-1 es la masa molar de agua y ϕ0 es la fracción de volumen del polímero en los hidrogeles antes del hinchamiento. Para las muestras preparadas en este estudio, no se utilizó ningún disolvente adicional durante la reticulación y ϕ0 fue 1. Para la estimación del tamaño de malla de los hidrogeles preparados por Tan et al., se utilizó su ϕ0 informado de 0,2 con una EDS de 9,2715.

Las curvas dependientes del pH del potencial zeta de las superficies de hidrogel se midieron con un analizador electrocinético (Surpass™, Anton Paar GmbH). Todas las muestras se perforaron en un tamaño de 1 cm x 2 cm y se lavaron e hincharon en KCl 1 mM durante 72 h para equilibrar. Después de retirar la solución restante con un papel de filtro, se fijaron en soportes de muestra con cinta de doble cara (tesafix® 4965 original) y se descartó el material de hidrogel sobrante. Los portamuestras se montaron en la celda de separación ajustable, que se montó en el analizador electrocinético. La solución de electrolito recién preparada que constaba de KCl 1 mM se purgó con gas nitrógeno como sugiere el fabricante. El potencial zeta dependiente del pH se determinó midiendo la corriente de flujo en el rango de pH de aproximadamente 2,5 a 10,4 usando HCl 0,1 M y KOH 0,1 M, midiendo desde pH ácido a básico, con un espacio de muestra entre 100 µm y 120 µm. El valor de pH donde el potencial zeta era 0 mV se tomó como punto isoeléctrico de la muestra. Se utilizó agua desionizada con una conductividad de 0,055 µS cm-1 (arium® pro, Sartorius AG).

Los ángulos de contacto con el agua (WCA) y la energía superficial libre (SE) se midieron mediante análisis de vídeo (DataPhysics Instruments GmbH, OCA 40). Se perforaron muestras de un tamaño de 1 cm x 2 cm y se midió el WCA con cuatro gotas de 2 µl de agua desionizada con el método de la gota sésil (SD). Los vídeos se analizaron posteriormente y se eligió el punto de tiempo de 1 s para comparar. Se realizó el mismo procedimiento para los hidrogeles que se hincharon en agua desionizada durante 72 h.

El SE de las muestras se determinó midiendo el ángulo de contacto con los tres líquidos agua desionizada (según Ström et al.: SE = 72,8 mN m-1, porción polar (σp) = 51,0 mN m-1, porción dispersa (σd) = 21,8 mN m−1)46, diyodometano (según Ström et al.: SE = 50,8 mN m−1, σp = 0,0 mN m−1, σd = 50,8 mN m−1)46 y etilenglicol (según Gebhardt : SE = 47,7 mN m−1, σp = 21,3 mN m−1, σd = 26,4 mN m−1)47. Como antes, se grabó un vídeo y se analizaron los valores después de 1 s. El volumen de la gota también fue de 2 µl y se midieron cuatro gotas por muestra. Luego se determinó el SE con el modelo de Owens-Wendt-Rabel-Kälble (OWRK)48,49,50.

Para las mediciones de burbujas cautivas (CB), los hidrogeles se hincharon en agua desionizada durante 72 h. El agua restante se eliminó con un papel de filtro, los hidrogeles se fijaron en cubreobjetos con cinta adhesiva de doble cara (tesafix® 4965 original) y se colocaron en un recipiente lleno de agua desionizada. Se midió el ángulo de contacto de una burbuja de aire (10 µL) liberada por una cánula en forma de J y se determinó la WCA respectiva. Se midieron tres burbujas por muestra.

Las posibles propiedades antibacterianas de los hidrogeles se evaluaron según la norma ISO 22.196 con Escherichia coli (E. coli) DSM 1576. Muestras de PEGDA-0 y PEGDA-2, ambas n = 2, en el tamaño de 2 cm × 2 cm, así como Las películas plásticas del tamaño apropiado se esterilizaron mediante tratamiento UV (Bio-Link BLX-312, Vilber) con 254 nm y 0,48 mW cm-2 durante 20 min o 3 h, respectivamente. Las bacterias se inocularon en agar LB durante la noche a 35 °C ± 1 °C y el precultivo se cultivó durante la noche en medio LB a 35 °C ± 1 °C. Las suspensiones de bacterias se diluyeron a una concentración de 6 × 105 unidades formadoras de colonias (UFC) ml-1. Se agregaron 300 µL de la suspensión sobre las superficies de la muestra y se colocaron las películas plásticas encima. Las bacterias se eliminaron de las superficies y las películas con 10 ml de PBS directamente (0 h) o después de 24 h de incubación (24 h) a 35 °C ± 1 °C. La suspensión de bacterias se diluyó en PBS en dos concentraciones y cada una se sembró en agar LB (n = 3). Las placas de agar se incubaron durante 24 h a 35 °C ± 1 °C y se contaron las UFC.

Inmediatamente después de la preparación se troquelaron y pesaron (mpol) muestras con un diámetro de 8 mm. Los hidrogeles se lavaron y se hincharon en agua desionizada durante 24 h. Los hidrogeles hinchados se sumergieron en 4 mL de solución acuosa de sal sódica de diclofenaco (DSS) con concentraciones iniciales c0 entre 0 y 1 mg mL-1 para la determinación de las isotermas de adsorción y en 4 mL de solución DSS con una concentración c0 = 0,1 mg. mL-1 para la cinética de adsorción. Los hidrogeles en solución de DSS se mantuvieron en agitación a 45 rpm y 20 °C durante 72 h para las isotermas de adsorción y durante un tiempo específico para la cinética de adsorción. Pasado este tiempo, parte del sobrenadante se transfirió a viales de HPLC. Las concentraciones de diclofenaco ce se determinaron mediante HPLC (Shimadzu Deutschland GmbH) utilizando un flujo isocrático de 1 mL min-1 de una mezcla de disolventes compuesta por 55% de agua desionizada (con 0,05% de TFA) y 45% de acetonitrilo. Se inyectó un volumen de 10 µL. Todas las mediciones se realizaron a 40 °C. Para la separación se utilizó una columna de fase inversa ReproSil™ XR C18 de 5 µm (Dr. Maisch GmbH). Las mediciones de calibración se realizaron utilizando doce soluciones estándar de DSS con concentraciones entre 0 y 1 mg mL-1. La evaluación de los cromatogramas se llevó a cabo midiendo la absorción de UV a 275 nm. Para determinar la concentración de diclofenaco de cada muestra, los picos de diclofenaco se integraron entre un tiempo de retención de 9,1 min y 10,3 min. La cantidad ae de diclofenaco contenida por masa de hidrogel se determinó mediante la concentración medida ce en el sobrenadante como

Md es la masa molar de DSS (318,13 g mol-1). Los datos de adsorción resultantes se describieron con modelos de adsorción comunes. Con el modelo de adsorción de Langmuir, la concentración qe de diclofenaco adsorbido en la red polimérica de hidrogel se describe mediante:

qm es la capacidad máxima de adsorción de la red polimérica de hidrogel, Ks es la relación entre las constantes de velocidad de adsorción y desorción. Además, el diclofenaco también está presente en el agua que es el medio de hinchamiento de la red de hidrogel, por lo que la concentración total de diclofenaco en el hidrogel se describe mediante51:

φΗ2Ο es la fracción de volumen de agua (\({\varphi }_{\mathrm{H}2\mathrm{O}}=1-\phi\)) y ρH la densidad del hidrogel. El coeficiente de partición k se define como la relación entre la concentración de adsorbato en el hidrogel y la concentración de equilibrio en el sobrenadante:

Los factores de mejora se pueden calcular como la relación entre los coeficientes de partición reales medidos y los coeficientes de partición ideales que igualan la fracción de volumen de agua de los geles52.

Los hidrogeles se hincharon en agua desionizada durante al menos 16 h. Para reducir los grupos de isotiouronio a tioles, se perforaron hidrogeles del tamaño de 1 cm × 2 cm y se transfirieron a 5 ml de una solución de metabisulfito de sodio 1 M (Na2S2O5) y la solución se calentó hasta 60 °C durante 5 h. Estos hidrogeles tratados se denominan además hidrogeles PEGDA-T. Las muestras de control no tratadas se hincharon en 5 ml de agua desionizada fresca a temperatura ambiente durante 5 h (hidrogeles PEGDA-NT). Después de enfriar a temperatura ambiente, se descartaron los sobrenadantes y las muestras se lavaron brevemente con 5 ml de PBS. A partir de este momento, todos los hidrogeles se lavaron con PBS al menos 5 veces durante 30 minutos hasta que el valor del pH de la solución de lavado fue de aprox. 7.2.

La tinción fluorescente con un tinte de maleimida se llevó a cabo después de que los hidrogeles se mantuvieran en PBS fresco durante la noche. Los hidrogeles se troquelaron en discos con un diámetro de 8 mm. Después de otro paso de lavado con PBS, los hidrogeles se tiñeron con el fluoróforo de maleimida Atto488 sumergiéndolos en 2 ml de una solución de tinción de 25 µM (obtenida diluyendo una solución madre de 1 mM en DMSO 1:40 con agua desionizada) durante 2 h a RT bajo la protección de la luz. Posteriormente, los hidrogeles se lavaron brevemente en PBS y luego se lavaron 7 veces en PBS durante 30 minutos y se mantuvieron en PBS más adelante. Todos los pasos de lavado se realizaron bajo la protección de la luz. Para investigar los hidrogeles se utilizó un microscopio de barrido láser confocal (LSM) (LSM 710, AxioObserver, Carl Zeiss) con el objetivo Zeiss EC Plan-Neofluar 10x/0,30 M27. La configuración del microscopio se mantuvo idéntica para cada muestra y se generaron pilas z utilizando el láser Argon de 488 nm. Los datos se convirtieron en una proyección de intensidad máxima (MIP) 2 D y la intensidad de fluorescencia media de la MIP se determinó con Fiji (2.1.0)53.

Después de los pasos de lavado con PBS, los hidrogeles PEGDA-0NT, PEGDA-0T, PEGDA-2NT y PEGDA-2T se perforaron en un tamaño de 8 mm y se colocaron en una placa de 24 pocillos. Se diluyó adicionalmente un conector maleimida-PEG11-biotina en una solución madre 250 mM en DMSO hasta una concentración de 5 µM mediante la adición de PBS. Se agregaron 500 µL de la solución a la mitad de los hidrogeles y la otra mitad se sumergió en PBS. Los hidrogeles se agitaron durante 5 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron brevemente en PBS y luego se lavaron 7 veces en PBS durante 30 minutos y se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Se añadió a cada uno de los hidrogeles una solución de 2,5 µg mL-1 de peroxidasa de rábano picante acoplada a estreptavidina (SA-HRP) en PBS en un volumen de 500 µL durante 5 h a 4 °C. Los hidrogeles se lavaron brevemente en PBS y se lavaron nuevamente 7 veces durante 30 min a 4 °C. Se añadieron 500 µl de solución ABTS a cada pocillo y se midió la absorción a 405 nm durante aprox. 30 minutos. Los hidrogeles PEGDA-0NT sin la adición del conector sirvieron como blanco.

Se utilizó un análisis de varianza de una o dos vías (ANOVA) con la prueba post-hoc de Bonferroni para el análisis estadístico con OriginPro 2019b (OriginLab). Para valores de p <0,05, se consideró que los valores medios eran significativamente diferentes. Cada experimento, excepto el ensayo antibacteriano, se repitió de forma independiente al menos tres veces con preparaciones de muestras independientes.

La síntesis del monómero AUITB se basa en una reacción de dos pasos (Fig. 1a). En el primer paso, se sintetizó acrilato de 11-bromoundecilo mediante la acrilación de 11-bromo-1-undecanol con cloruro de acriloilo. Como subproducto se formó acrilato de 11-hidroxiundecilo. Sin embargo, este subproducto, que carecía del resto bromoalcano electrófilo, no era reactivo en las condiciones de reacción utilizadas en la segunda etapa de la reacción, por lo que no se realizó ninguna purificación adicional. En el segundo paso, AUITB se sintetizó mediante una sustitución nucleofílica con tiourea. Los datos espectrales indicaron una síntesis exitosa del monómero AUITB. Las señales de 1H RMN del grupo isotiouronio a 8,99 ppm coincidieron con informes anteriores54,55,56,57. El espectro Raman mostró la vibración de estiramiento típica del enlace CH en la cadena alquílica entre 2800 y 3000 cm-1 (Fig. 1d). La banda de 1714 cm-1 se asoció con el éster α,β-insaturado de la molécula. La banda a 1637 cm-1 estaba relacionada con la vibración de estiramiento del doble enlace C = C. En el mismo rango de números de onda también se localiza la banda del enlace N-H58. AUITB era soluble en cloroformo, dimetilsulfóxido, etanol y también en PEGDA puro, pero era insoluble en agua. Por lo tanto, se utilizaron soluciones de AUITB en PEGDA para la posterior preparación del hidrogel.

Preparación de hidrogel y evaluación del proceso de entrecruzamiento. (a) Síntesis de bromuro de 2-(11-(acriloiloxi)undecil)isotiouronio (AUITB). Primer paso: Síntesis de acrilato de 11-bromoundecilo mediante acrilación de 11-bromo-1-undecanol con cloruro de acriloilo. Segundo paso: Síntesis de AUITB mediante sustitución nucleofílica con tiourea. TÉ: trietilamina, THF: tetrahidrofurano, TA: temperatura ambiente, EtOH: etanol. (b) Preparación de muestras: 1. Pipetear la solución precursora sobre una oblea de silicio activado. 2. Cerrar el molde con una hoja de cristal de cuarzo. 3. Reticulación de la muestra mediante irradiación UV. 4. Retirar la muestra del molde. (c) Grado de equilibrio de hinchamiento (EDS) en gris y rendimiento de gel (Yg) en azul de hidrogeles a base de PEG dependiendo de la fracción de masa βAUITB de AUITB utilizada durante la preparación de la muestra. Los hidrogeles se hincharon en agua desionizada durante 72 h. Se muestran los resultados para PEGDA-0 (EDS: n = 10, Yg: n = 8), PEGDA-1 (EDS: n = 5, Yg: n = 3), PEGDA-2 (EDS: n = 6, Yg: n = 4) y hidrogeles PEGDA-3 (EDS: n = 5, Yg: n = 4). ( d ) Espectros Raman de AUITB, PEGDA sin reaccionar, una muestra de PEGDA-0 y una muestra de PEGDA-3. Las muestras de hidrogel se lavaron y secaron antes de registrar los espectros.

Se prepararon muestras de PEGDA con y sin el monómero AUITB mediante reticulación radical en moldes (Fig. 1b). Primero, se evaluó si la integración de AUITB interfería con el proceso de entrecruzamiento de PEGDA. Para ello se examinaron los grados de hinchamiento en equilibrio (EDS) y el rendimiento del gel (Yg). La Figura 1c muestra Yg y EDS en función de la fracción de masa βAUITB de AUITB utilizada durante la preparación de muestras para las muestras PEGDA-0, PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA-3. Tanto el Yg como el EDS fueron comparables para las diferentes composiciones de hidrogel. Los valores medios de Yg oscilaron entre 0,97 y 0,99, lo que indica una integración casi cuantitativa de todos los materiales de partida en la red polimérica para todas las muestras. La EDS estuvo entre 0,52 y 0,54, muy similar a la EDS de 0,49 reportada por Mellott et al. para esferas preparadas con PEGDA (Mn = 575 g mol-1)14.

Es interesante observar que la introducción del monómero cargado AUITB no alteró significativamente las propiedades de hinchamiento, en contraste con nuestras expectativas y con estudios previos con monómeros que portan grupos iónicos. Por ejemplo, Tan et al. preparó hidrogeles de PEGDA (Mn = 4000 g mol-1) con el monómero cloruro de 2-(metacriloiloxi)etiltrimetilamonio (MAETAC) que tiene un grupo de amonio cuaternario15. Sus soluciones antes del curado contenían 20% p/v de PEGDA, lo que condujo a una EDS de 9,3 sin MAETAC y a una EDS de 15,6 con aprox. 20,8% en peso de MAETAC con respecto a la masa de PEGDA. Sin embargo, existen diferencias importantes entre nuestros experimentos y los datos descritos por Tan et al. Con hasta un 3% en peso de AUITB en nuestra solución precursora, la fracción del monómero funcional es mucho menor. Por tanto, la relación molar de AUITB y PEGDA ascendió hasta el 5,7%. Teniendo en cuenta los dos grupos polimerizables por molécula de PEGDA, esto da como resultado una fracción teórica de unidades repetidas funcionalizadas con isotiouronio en la cadena principal de poliacrilato del 2,8%. Además, a diferencia de MAETAC, AUITB tiene una cadena alquílica hidrófoba que probablemente disminuirá bastante la EDS. Además, consideramos una de las diferencias clave la densidad de reticulación de los hidrogeles PEGDA puros. Usando la ecuación. 4 para estimar la masa molar entre enlaces cruzados, se obtiene un valor de 48 g mol-1 para nuestras muestras, que está cerca de una unidad repetitiva de la estructura principal de PEG, en contraste con un valor de 1145 g mol-1 para las muestras de Tan et al. Por lo tanto, nuestros hidrogeles contienen redes de polímeros densamente reticuladas que ofrecen posibilidades muy limitadas para que la red se expanda, también después de la adición de AUITB. Por lo tanto, los datos de EDS en combinación con los datos de Yg sugieren que AUITB no interfirió con el proceso de reticulación de PEGDA para las concentraciones probadas.

Para confirmar este hallazgo, se registraron espectros Raman de AUITB, PEGDA sin reaccionar, una muestra de PEGDA-0 y una muestra de PEGDA-3. Los espectros se representan en la Fig. 1d.

Todos los espectros tenían las bandas características de las vibraciones de estiramiento del enlace CH entre 2600 y 3000 cm-1. La banda > 3000 cm−1 en el espectro del PEGDA que no ha reaccionado se debe a la vibración de estiramiento del CH en el doble enlace. Este espectro también tenía una banda fuerte con un pico en 1637 cm-1, que puede asignarse al doble enlace C = C. Los espectros de las muestras de PEGDA-0 y PEGDA-3 reticuladas fueron comparables y mostraron una banda casi desaparecida alrededor de 1600 cm-1. Esto indica que la reticulación de las muestras fue exitosa, incluido el consumo del doble enlace C = C, y que la integración del monómero en la solución precursora no interfirió con el proceso de reticulación. Desafortunadamente, en el espectro de PEGDA-3 no se vio evidencia directa que demuestre la integración exitosa de AUITB, probablemente debido al tamaño bastante pequeño de βAUITB. En resumen, los espectros Raman también señalan que la adición de AUITB no obstaculizó la reticulación de los hidrogeles PEGDA.

Para evaluar más a fondo si la funcionalización de los hidrogeles PEGDA con AUITB fue detectable y exitosa, se examinaron sus puntos isoeléctricos (IEP), es decir, el valor de pH donde la carga neta es cero, midiendo el potencial zeta en función del pH. valor (Figura SI 4). En la Fig. 2a ("original"), se muestran los IEP de muestras con βAUITB entre 0% en peso y 3% en peso. Los hidrogeles se hincharon en KCl 1 mM después de la reticulación durante tres días para facilitar las mediciones, pero aparte de eso no recibieron ningún tratamiento químico. Generalmente, el IEP de los hidrogeles aumentó al aumentar βAUITB. Sus IEP oscilaron entre 4,5 ± 0,1 (PEGDA-0) y 9,0 ± 0,1 (PEGDA-2). Para la superficie no funcionalizada de las muestras PEGDA-0, se requiere un IEP de aprox. Se esperaban 459. Se ha informado anteriormente que los hidrogeles basados ​​en PEG tienen su IEP en este rango de pH60,61,62 probablemente causado por la adsorción de iones de hidróxido en la superficie61,63,64. Al aumentar βAUITB, el IEP cambió a valores en el rango de pH básico. Si una superficie sólida solo tiene un grupo funcional, se informa que el IEP de esta superficie está fuertemente relacionado con el valor de pKa de este grupo59. Se espera que el valor de pKa de los grupos de isotiouronio esté en la región básica65,66,67. Para las nanopartículas funcionalizadas con isotiouronio, se ha informado un IEP de 10,227. Estos hallazgos están de acuerdo con el IEP medido para el βAUITB más alto de 2 % en peso y 3 % en peso. Por lo tanto, los resultados sugieren que la funcionalización de los hidrogeles de PEGDA condujo a una carga superficial y que la cantidad de grupos de isotiouronio dentro de las muestras se correlacionaba con el βAUITB utilizado durante la preparación.

Caracterización de los hidrogeles funcionales de isotiouronio. (a) Puntos isoeléctricos (IEP) dependiendo de la fracción de masa βAUITB de AUITB utilizada durante la preparación de la muestra. Se muestran los resultados para los hidrogeles PEGDA-0, PEGDA-0.1, PEGDA-0.5, PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA-3 (n = 3). Los hidrogeles se hincharon en KCl 1 mM después de la reticulación (original) o se trataron con Na2S2O5 1 M y se mantuvieron en KCl 1 mM después (tratados). Explicación de los símbolos: *** significativamente diferente a los hidrogeles PEGDA-0 (p < 0,001); ^^ significativamente diferente a los hidrogeles PEGDA-1 (p < 0,01), °°° diferencias significativas entre los tratamientos de muestra (p < 0,001). (b) Ángulos de contacto con el agua que dependen de βAUITB de muestras secas e hinchadas, medidos mediante el método de gota sésil (SD) o burbuja cautiva (CB) (n = 3, método SD PEGDA-2 n = 4). Explicación de símbolos: °°° diferencias significativas entre métodos (p < 0,001). (c) y (d) Adsorción de diclofenaco en hidrogeles con funcionalidad isotiouronio. (c) Las concentraciones de diclofenaco se adsorben dentro de los hidrogeles PEGDA-0, PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA-3, determinadas para diferentes concentraciones de sobrenadante de equilibrio de diclofenaco. Los puntos de datos experimentales se ajustaron con un modelo de Langmuir modificado según la ecuación. 7 (líneas continuas). (d) Factores de mejora E de diclofenaco dentro de las muestras analizadas. Los puntos de datos se calcularon utilizando la ecuación. 9 con los valores experimentales de ae y ce, y las líneas continuas se calcularon con la misma ecuación expresando ae con los resultados de ajuste que se muestran en la Tabla 1.

Para evaluar más a fondo el efecto de la adición de AUITB a los hidrogeles, se realizaron mediciones del ángulo de contacto. Es concebible que debido a la estructura anfifílica de AUITB, se generen propiedades superficiales más hidrofílicas o más hidrofóbicas tras la integración de AUITB. Por lo tanto, primero se midieron los ángulos de contacto con el agua (WCA) de muestras secas e hinchadas en contacto con el aire con el método de gota sésil (SD) (Fig. 2b). Para las muestras secas de PEGDA-0, se midió un WCA de 48,4° ± 1,8° mientras que las muestras de PEGDA-3 tenían un WCA de 56,2° ± 0,4°. Además, los hidrogeles de PEGDA-0 hinchados tenían un WCA de 44,7° ± 2,4° y los hidrogeles de PEGDA-3 hinchados un WCA de 49,9° ± 3,0°. Por lo tanto, hubo una tendencia hacia el aumento de WCA al aumentar βAUITB, lo que implica superficies más hidrofóbicas, probablemente causadas por la cadena alquílica hidrofóbica de AUITB. Este resultado fue respaldado por la medición de las energías superficiales (SE) de las muestras secas (Figura SI 5). Todas las muestras tuvieron un SE comparable entre 51 y 53 mN m-1, lo que permitió la comparación de las porciones polares y dispersas. Se detectó una tendencia hacia la disminución de las porciones polares al aumentar βAUITB. Las muestras de PEGDA-3 tenían porciones polares de 12,7 mN m-1 ± 0,2 mN m-1 en comparación con las muestras de PEGDA-0 con 15,6 mN m-1 ± 0,6 mN m-1.

Sin embargo, curiosamente se obtuvo un resultado diferente al medir las WCA con el método de burbuja cautiva (CB), durante el cual las muestras se sumergen en agua. Las mediciones CB dieron como resultado ángulos de contacto similares de los hidrogeles PEGDA-0 en comparación con las mediciones SD de los hidrogeles PEGDA-0 hinchados con 45,4° ± 0,5°. En contraste con los datos de SD, el WCA disminuyó al aumentar βAUITB, de modo que los hidrogeles de PEGDA-3 tuvieron un WCA de 34,6° ± 2,7°. Atribuimos esta observación a un cambio de orientación de los grupos de isotiouronio en muestras sumergidas en agua. Esto es posible debido a que los grupos isotiouronio están unidos a la cadena alquilo flexible que puede cambiar de conformación dependiendo del medio circundante. En contacto con el aire no polar, la cadena alquilo queda expuesta a la superficie de la muestra, mientras que en contacto con el agua se presenta el grupo isotiouronio iónico. Yokoyama et al.68 informaron anteriormente de un efecto similar de la reorientación de las cadenas laterales inducida por el medio circundante. Mezclaron un copolímero en bloque de poliestireno deuterado (dPS) y metacrilato de 2-[2-(2-metoxietoxi)-etoxi]etilo (PME3MA) con poliestireno (PS) y midieron la disminución de los ángulos de contacto de avance y retroceso y una mayor histéresis al aumentar la concentración de dPS-PME3MA en PS. Plantearon la hipótesis de que este efecto se debe a la reconstrucción de la superficie de las partes hidrófilas de PME3MA, que pueden formar una capa de cepillo sobre PS. Cuando se expusieron al aire, los extremos metílicos se ubicaron en la superficie68. Estas reorganizaciones de la superficie probablemente tengan lugar para disminuir la energía libre interfacial68,69,70.

De hecho, nuestro método utilizado para preparar las muestras implicó el contacto de la superficie analizada con una superficie de silicio hidrófilo. El motivo detrás de esto fue permitir que los grupos de isotiouronio estuvieran presentes en las superficies de la muestra. Las mediciones del WCA confirman ahora este enfoque. Bongiovanni et al. describieron previamente un método similar. quienes prepararon películas acrílicas y agregaron monómeros acrílicos con diferentes longitudes de cadenas alquílicas a una resina epoxi acrílica71. Mientras se reticulaban esas películas, un lado se expuso a una atmósfera inerte y el otro a un sustrato de vidrio. Informaron de una distribución asimétrica de los monómeros, dependiendo de la longitud de la cadena alquílica y de la concentración de monómeros, y encontraron ángulos de contacto de avance crecientes en el lado de la película orientado hacia la atmósfera inerte. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la combinación de nuestro procedimiento de preparación de muestras y un medio circundante polar como el agua hace que los grupos de isotiouronio sean accesibles en las superficies de las muestras, como también lo sugieren los datos del IEP descritos anteriormente. Además, los resultados también indican una densidad superficial comparable de los grupos isotiouronio para los hidrogeles PEGDA-2 y PEGDA-3.

Además, se evaluaron las posibles propiedades antibacterianas de las superficies de hidrogel para hidrogeles PEGDA-2 y PEGDA-0 con la cepa bacteriana de referencia E. coli DSM 1576 según ISO 22.196 en condiciones estáticas (Figura SI 6). Se sembraron UFC mL-1 comparables de E. coli en las superficies del hidrogel con (185 ± 41) UFC mL-1 para PEGDA-0 y (177 ± 22) UFC mL-1 para hidrogeles PEGDA-2. Después de 24 h de tiempo de contacto con las muestras se contaron (520 ± 117) UFC mL-1 en hidrogeles PEGDA-0 y (395 ± 49) UFC mL-1 en hidrogeles PEGDA-2, mostrando una ligera tendencia de menos bacterias en PEGDA. -2 hidrogeles. El efecto de los grupos de isotiouronio sobre las bacterias fue investigado anteriormente por Cohen et al. utilizando un procedimiento en condiciones dinámicas27. Agregaron nanopartículas de poliisotiouronio metilestireno a suspensiones de bacterias, incluida E. coli, y demostraron propiedades antibacterianas de las nanopartículas. Nuestros datos no sugieren un efecto antibacteriano distinto. Dado que las bacterias debían eliminarse de la muestra y de las superficies de la película antes de contarse, se esperaban y también se determinaron errores mayores. Además, se desconoce el número de grupos de isotiouronio disponibles en las superficies del hidrogel y probablemente sea menor en comparación con las nanopartículas funcionalizadas.

Como se mencionó anteriormente, los materiales funcionalizados con isotiouronio se pueden usar como adsorbentes de iones de metales pesados. En esta contribución, quisimos evaluar el potencial de los hidrogeles funcionalizados con isotiouronio para la adsorción de productos farmacéuticos como el diclofenaco, que se ofrecía en su forma iónica de DSS. Para ello, se midieron las isotermas de adsorción, es decir, la concentración ae de diclofenaco dentro de los hidrogeles en función de la concentración de equilibrio ce en el sobrenadante (ecuación 7), para PEGDA-0, PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA- 3, como se muestra en la Fig. 2c. Se encontró que el tiempo de adsorción para alcanzar las condiciones de equilibrio fue de 72 h, como se muestra en la Figura SI 7. Las formas generales de las isotermas de las muestras funcionalizadas con isotiouronio fueron similares. Los resultados muestran aumentos pronunciados de ae al aumentar la ce para todos los hidrogeles que contienen AUITB a baja ce. A valores de ce más altos, las isotermas se aplanaron y se acercaron a una meseta. También fue evidente que los valores máximos de ae aumentaron con la concentración de AUITB. Para una comprensión cuantitativa, las isotermas se ajustaron utilizando la ecuación. 7 y se obtuvieron las capacidades de adsorción qm, es decir, el nivel de la meseta, y las constantes de equilibrio Ks (Tabla 1). Los valores de qm oscilaron entre 25,7 y 74,9 µmol g−1, aumentando proporcionalmente con βAUITB. Esta observación es consistente con la suposición de que, efectivamente, los grupos isotiouronio provocan la adsorción de diclofenaco dentro de las muestras, probablemente mediante un intercambio iónico. Esta conclusión se ve respaldada aún más por la isoterma de adsorción de PEGDA-0, que es casi lineal sin mostrar ninguna meseta. Esto es indicativo de una adsorción inespecífica debido a la ausencia de grupos isotiouronio. Además, el valor máximo de ae fue de 9,9 µmol g-1 para las muestras no funcionalizadas, por lo que es mucho más bajo que para todas las muestras que contienen AUITB. Tenga en cuenta que los resultados de ajuste para PEGDA-0 en la Tabla 1 se incluyeron para completar, pero no son significativos debido a los grandes errores estándar.

Se encuentra una imagen similar al observar los factores de mejora E del diclofenaco en los hidrogeles, es decir, la relación entre las concentraciones de diclofenaco dentro del hidrogel y el sobrenadante (Fig. 2d). Para los hidrogeles PEGDA-1, PEGDA-2 y PEGDA-3, se lograron factores de mejora máximos de 14.911, 89.923 y 85.461, mientras que para los hidrogeles PEGDA-0 no funcionalizados se determinó un valor máximo de 239. De hecho, los grandes factores de mejora dan lugar a la conclusión de que la funcionalización de isotiouronio da como resultado una fuerte interacción con el anión diclofenaco, mientras que la capacidad de adsorción de los hidrogeles se puede ajustar variando la cantidad de monómero AUITB. La fuerte afinidad de los grupos isotiouronio por el diclofenaco también es evidente al comparar los valores qm y Ks de la Tabla 1 con los resultados informados anteriormente para la adsorción de diclofenaco. En cuanto a qm, un valor más alto de 344,8 mg g-1 (1083 µmol g-1) fue encontrado, por ejemplo, por Liu et al. con nanopartículas poliméricas preparadas con el monómero cargado positivamente MAETAC25, o de 129,42 mg g−1 (406 µmol g−1) por Mahmoodi et al. con hidrogeles de quitosano y óxido de grafeno funcionalizados con melamina72. Esto puede explicarse simplemente por la diferente concentración de los sitios de adsorción, como también se desprende del aumento proporcional de qm con βAUITB. Una mayor afinidad está relacionada con un valor de Ks más alto. De hecho, el valor para muestras de PEGDA-3 de 192 ml µmol-1 supera los valores de 0,1663 L mg-1 (52,9 ml µmol-1) y 0,336 ppm-1 (107,0 ml µmol-1) informados anteriormente por Liu et al. 25 y Mahmoody et al.72 Los grupos de isotiouronio presentes en los hidrogeles de nuestro estudio muestran, por tanto, una mayor afinidad por el diclofenaco que los grupos funcionales de los informes anteriores.

Los grupos isotiouronio son precursores sintéticos de los tioles, como se explica en la introducción. Por lo tanto, tratamos las muestras funcionalizadas con isotiouronio con metabisulfito de sodio para reducirlas a tioles. Las muestras así tratadas se indican con una "T" en sus nombres de muestra. Las muestras de control que se sometieron a los mismos pasos de lavado, pero omitiendo el metabisulfito de sodio en las soluciones, se indican con una "NT" en los nombres de sus muestras. El efecto del tratamiento se evaluó primero midiendo el IEP de las muestras (Fig. 2a). De hecho, los IEP disminuyeron drásticamente para las muestras tratadas y funcionalizadas a un nivel similar al de las muestras PEGDA-0. Esto demuestra que los grupos isotiouronio se convirtieron en restos neutros durante la reacción, lo que coincide con la presencia de tioles.

En un segundo paso, se evaluó la reactividad de las muestras tratadas mediante tinción fluorescente de los hidrogeles. Los tioles se tiñeron mediante una reacción de tiol-Michael con el tinte fluorescente Atto488 maleimida. En la Fig. 3a, se representa la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas y de control. Las Figuras 3b yc muestran imágenes de fluorescencia representativas después de la tinción de los hidrogeles PEGDA-0T y PEGDA-3T. En la Figura SI 8 se enumeran imágenes representativas después de la tinción de todas las demás composiciones de hidrogel probadas.

Funcionalidades de los hidrogeles basados ​​en PEG que contienen tiol. ( a ) Intensidad de fluorescencia medida para hidrogeles con isotiouronio (no tratado) y funcionalización con tiol (tratado) después de teñir con maleimida Atto488 en función de la fracción de masa βAUITB de AUITB utilizada durante la preparación del hidrogel. Las muestras tratadas se redujeron químicamente con metabisulfito de sodio (Na2S2O5) y las no tratadas se mantuvieron en agua. Los cuadros muestran los percentiles 25 y 75. La línea horizontal en los cuadros es la mediana y el cuadrado es la media. (PEGDA-0, PEGDA-3: n = 4, PEGDA-1, PEGDA-2: n = 3). Explicación de los símbolos: *** significativamente diferente a los hidrogeles PEGDA-0 (p < 0,001); ^^ significativamente diferente a los hidrogeles PEGDA-1 (p < 0,01), °°° diferencias significativas entre los tratamientos de muestra (p < 0,001). ( b, c ) Imágenes de fluorescencia ejemplares de hidrogeles teñidos. (b) hidrogel PEGDA-0T. (c) hidrogel PEGDA-3T. Barra de escala 100 µm. (d) Mediciones de absorción dependientes del tiempo de la conversión del sustrato ABTS al ABTS+ verde mediante peroxidasa de rábano picante unida a los hidrogeles. Los hidrogeles PEGDA-0NT sin la adición del conector sirvieron como blanco. Se encontraron efectos significativos para las medias en la composición de la muestra y el tiempo, la interacción de la composición de la muestra y el tiempo también fue significativa.

Generalmente, la intensidad de la fluorescencia después de la tinción de las muestras tratadas aumentó con la fracción de masa βAUITB de AUITB utilizada para la preparación de la muestra (Fig. 3a), mientras que las muestras no tratadas que aún contenían los grupos de isotiouronio se tiñeron en una medida mucho menor. Esto también se observó visualmente mediante un cambio de color de los hidrogeles (Figura SI 9). Además, tanto las muestras de PEGDA-0 tratadas como las no tratadas no mostraron tinción. Esto se explica por la reactividad de los tioles formados en las muestras tratadas, anteriormente funcionalizadas con isotiouronio, hacia el tinte fluorescente, lo que da como resultado una unión covalente, que no es posible ni para las muestras de PEGDA-0 no tratadas ni para las tratadas. La pequeña intensidad de fluorescencia de las muestras no tratadas se atribuye a la interacción electrostática del colorante cargado negativamente y los grupos isotiouronio. En conjunto, las observaciones son una fuerte indicación de que, efectivamente, se formaron tioles que eran completamente accesibles y reactivos, lo que los hacía adecuados para su uso en futuras reacciones de bioconjugación. Además, la cantidad de tioles disponibles para el acoplamiento aumenta con βAUITB. De hecho, ya se informó anteriormente que los grupos isotiouronio se pueden reducir con éxito a tioles con metabisulfito de sodio32.

En un siguiente paso, los hidrogeles funcionalizados con tiol se utilizaron para conjugar la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). Esto se logró en un proceso de dos pasos acoplando primero un conector funcional de biotina a través de una reacción de tiol-Michael a las muestras y posteriormente usando la interacción biotina-estreptavidina para unir un conjugado de estreptavidina-HRP (SA-HRP), una estrategia similar a un informe de Koch et al.38. Para distinguir entre la adsorción inespecífica de SA-HRP en los hidrogeles y la reacción de bioconjugación deseada, se realizaron experimentos de control sin el conector. El éxito de la reacción se evaluó mediante la conversión de ABTS al catión radical ABTS+ verde que se midió fotométricamente (Fig. 3d). Los hidrogeles PEGDA-2T, que se agitaron primero en solución enlazadora y luego en solución enzimática (PEGDA-2T + enlazador), tuvieron la absorción más alta de 0,111 después de 34 minutos en solución de sustrato ABTS. Los hidrogeles PEGDA-2T sin el conector tuvieron una absorción menor de 0,042 en el mismo momento. Los hidrogeles PEGDA-0T tuvieron una absorción de 0,030 con y 0,001 sin el conector a los 34 min. Como se esperaba, los hidrogeles PEGDA-2T + Linker tuvieron la mayor absorción. Debido a sus tioles, el conector maleimida se unió covalentemente a los hidrogeles, que se utilizó en el siguiente paso para unir la enzima acoplada a estreptavidina con biotina. Sin el conector, los hidrogeles PEGDA-2T solo podían unirse de manera inespecífica al SA-HRP y, por lo tanto, la absorción era menor. Los hidrogeles PEGDA-0T tuvieron la absorción más baja, lo que demuestra la baja adsorción de proteínas inespecífica en los hidrogeles PEGDA. Los hidrogeles PEGDA-2NT, que contienen grupos de isotiouronio, alcanzaron valores de absorción de 0,081 con y 0,070 sin el conector, mostrando nuevamente una interacción entre los grupos de isotiouronio y las maleimidas y también un efecto de los grupos con respecto a la adsorción de proteínas (datos mostrados en la Figura SI 10 ). En resumen, se demostró que los hidrogeles funcionalizados con tiol pueden servir como anclaje para una mayor funcionalización y, en este caso, para reacciones de bioconjugación.

Demostramos con éxito que los grupos de isotiouronio se pueden introducir en hidrogeles mediante una simple copolimerización radical del monómero isotiouronio funcional AUITB con PEGDA. Los grupos de isotiouronio son totalmente accesibles en la superficie de la muestra, especialmente en medios polares, mientras se orientan hacia la masa de la muestra en contacto con el aire. Además, los grupos isotiouronio también son totalmente accesibles dentro de la muestra, lo que hace que las muestras sean muy efectivas en la adsorción de diclofenaco. Generalmente, las propiedades de la muestra cambiaron monótonamente con la fracción de masa de AUITB utilizada durante la preparación de la muestra, lo que permitió un control preciso de las propiedades del material. Finalmente, los grupos isotiouronio se pueden reducir fácilmente a tioles, aprovechando así todo el potencial de la versátil reactividad del tiol para reacciones de bioconjugación, como la inmovilización enzimática. En conclusión, los resultados muestran que la funcionalización con isotiouronio ofrece una forma atractiva y sencilla de introducir funcionalidad química en hidrogeles.

Todos los datos están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

JG agradece la financiación de la beca de doctorado de la Fundación Evonik (Essen, Alemania). AS y GEMT agradecen a la Universidad de Stuttgart y al Ministerio de Ciencia, Investigación y Artes del Estado federado de Baden-Württemberg (Alemania) la financiación dentro del Leistungszentrum Mass Personality (https://www.masspersonalization.de/). JG agradece amablemente a Friederike Dehli (Instituto de Química Física, Universidad de Stuttgart) y a la Plataforma Tecnológica "Análisis Celular" del Centro de Investigación de Biología de Sistemas de Stuttgart por el apoyo y la asistencia con las mediciones del LSM. JG agradece a Daniela Urban (Instituto de Ingeniería de Procesos Interfaciales y Tecnología de Plasma IGVP, Universidad de Stuttgart) por la ayuda con las mediciones de EDS y Yg. JG también agradece a la Prof. Dra. Christina Wege (Instituto de Biomateriales y Sistemas Biomoleculares, Universidad de Stuttgart) por sus útiles debates y apoyo. Los autores agradecen a la Dra. Birgit Claaßen (Instituto de Química Orgánica, Universidad de Stuttgart) y su grupo por las mediciones de RMN. Los autores agradecen a la Universidad de Stuttgart (Stuttgart) y a la Fraunhofer-Gesellschaft (Munich) por proporcionar la infraestructura.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Alejandro Southan

Dirección actual: Instituto Max Planck de Sistemas Inteligentes, Heisenbergstr. 3, 70569, Stuttgart, Alemania

Instituto de Ingeniería de Procesos Interfaciales y Tecnología del Plasma IGVP, Universidad de Stuttgart, Nobelstr. 12, 70569, Stuttgart, Alemania

Jana Grübel, Vanessa L. Albernaz, Anastasia Tsianaka, Corinna O. Jauch, Silia Quirin, Günter EM Tovar y Alexander Southan

Instituto Fraunhofer de Ingeniería Interfacial y Biotecnología IGB, Nobelstr. 12, 70569, Stuttgart, Alemania

Christian Kerger, Christina G. Kohl, Anke Burger-Kentischer y Günter EM Tovar

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JG: Conceptualización, Metodología, Investigación, Análisis Formal, Visualización, Escritura—borrador original. VA: Metodología, Redacción: revisión y edición. AT: Metodología, Investigación, Escritura—borrador original. COJ: Investigación, redacción: revisión y edición. SQ: Investigación, redacción: revisión y edición. CK: Metodología, investigación, Redacción—revisión y edición, CGK: Metodología, Redacción—revisión y edición, AB-K.: Redacción—revisión y edición, GEMT: Redacción—revisión y edición, Supervisión. AS: Conceptualización, Metodología, Visualización, Redacción: revisión y edición, Supervisión.

Correspondencia a Günter EM Tovar o Alexander Southan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Grübel, J., L. Albernaz, V., Tsianaka, A. et al. Preparación de hidrogeles multifuncionales con grupos isotiouronio accesibles mediante copolimerización por reticulación radical. Representante científico 13, 10361 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36956-x

Descargar cita

Recibido: 13 de febrero de 2023

Aceptado: 13 de junio de 2023

Publicado: 26 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36956-x

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