Fabricación de chips de microfluidos espectroscópicos para la detección de mastitis en leche cruda

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6041 (2023) Citar este artículo

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La mastitis es una enfermedad que afecta directamente la cantidad y calidad de la leche producida por las vacas lecheras, lo que puede tener un impacto negativo en los ingresos generados por la venta de la leche. La inflamación grave causada por esta enfermedad mamaria puede provocar hasta 1 × 106 glóbulos blancos por mililitro de leche de vaca. Actualmente, la prueba de mastitis de California es una prueba de inspección química popular, pero su tasa de error de más del 40% es un factor importante en la propagación actual de la mastitis. En este estudio, se diseñó y fabricó un nuevo dispositivo de microfluidos para identificar mastitis normal, subclínica y clínica. Este dispositivo portátil permite un análisis preciso de los resultados en un segundo. El dispositivo fue diseñado para detectar células somáticas y se agregó un proceso de tinción para identificar células somáticas mediante análisis de procesos unicelulares. Se utilizó el principio de fluorescencia para identificar el estado de infección de la leche, que se analizó mediante un miniespectrómetro. Se probó la precisión del dispositivo y se descubrió que determinaba el estado de la infección con una precisión del 95%, en comparación con la precisión obtenida con la máquina Fossomatic. Al introducir este nuevo dispositivo de microfluidos, se cree que la propagación de la mastitis en las vacas lecheras se puede reducir significativamente, lo que conducirá a una producción de leche de mayor calidad y más rentable.

La mastitis en las vacas lecheras es un problema constante que enfrentan los productores de leche, ya que afecta directamente la cantidad y calidad de la leche cruda, lo que resulta en pérdidas económicas sustanciales. Se estima que la pérdida anual mundial ronda los 30 000 millones de euros1 y se compone de importantes pérdidas de leche, mala calidad de la leche, eliminación de animales crónicamente infectados y muertes ocasionales2. La mastitis es una inflamación de las glándulas mamarias causada por la invasión de ciertos patógenos, alergias o traumatismos físicos3, que resulta en cambios anormales en las glándulas mamarias y la leche. Generalmente existen dos tipos de mastitis: mastitis clínica y subclínica. Estos ocurren debido a diversas causas, incluidas infecciones bacterianas, heridas por toxinas infecciosas o exposición a sustancias químicas, siendo la causa más principal y frecuente la infección bacteriana. La mastitis puede transmitirse de ganado a ganado, aumentando su propagación. Si los síntomas de la mastitis se manifiestan después de un retraso en la detección, pueden impedir significativamente la curación de la vaca lechera durante aproximadamente 2 semanas. Esto puede provocar ceguera y una incapacidad permanente de la vaca para producir leche. Además, el manejo rutinario de la mastitis implica la administración de antibióticos para tratar y prevenir la enfermedad, lo que plantea un grave riesgo de resistencia a los antibióticos en la vaca. Hay dos etapas de diagnóstico: la primera consiste en evaluar el estado de la enfermedad para determinar su presencia y la segunda consiste en detectar el agente causal. En el caso de mastitis grave, el estado de la enfermedad se puede juzgar observando la apariencia del seno y la leche. Para detectar mastitis clínica o subclínica, se emplean pruebas de detección en granja para el análisis del recuento de células somáticas (SCC), como la prueba de mastitis de California (CMT). La determinación del RCS de la leche implica evaluar las células somáticas (SC) mediante microscopía de laboratorio, donde las SC de la leche se observan directamente en portaobjetos microscópicos como células teñidas y se cuentan con un operador. Analizar los resultados mediante este método lleva mucho tiempo y requiere que especialistas preparen la muestra4. La citometría de flujo (FCM) se puede utilizar para el análisis bacteriano y de RCS relativamente rápido de la leche5; Este método también requiere el apoyo de personal capacitado para manejar el hardware relativamente costoso necesario para el análisis y otros elementos desechables.

Los reactivos CMT pueden usarse simplemente para la prueba de mastitis y aplicarse para la estimación del RCS en una granja5. El reactivo utilizado en el CMT es el alquilarilsulfonato de sodio, basado en el principio de que los ácidos nucleicos y las células de otros elementos se liberan en presencia de alto SCC y formación de gel, lo cual es fácilmente detectable6,7. Sin embargo, los resultados obtenidos con este reactivo son falsos positivos o falsos negativos, y se observan bajas sensibilidades y especificidades para el SCC6,7,8. Ninguna de estas pruebas proporcionó un valor numérico exacto para el SCC porque los resultados se basaron en las características morfológicas percibidas por el ojo del sujeto de prueba, lo que resultó en imprecisiones. Además, estas pruebas no identifican el patógeno involucrado ni la virulencia de la infección, sino que solo brindan resultados positivos o negativos para la mastitis9,10.

Actualmente existen detectores de SCC como el contador Coulter (Coulter Electronics Ltd., Luton) y otros instrumentos automáticos que miden el SCC de forma indirecta, como los contadores de células Fossomatic y DeLaval (DeLaval, Tumba, Suecia). El contador Coulter es un dispositivo de alta velocidad utilizado para el análisis del tamaño de partículas que funciona según el principio de un contador de partículas electrónico. El uso de este contador implica agregar una solución de formaldehído a la leche a examinar para analizar las células somáticas y eliminar las partículas de grasa tratándolas con una solución lisante que se superpone en el rango de tamaño de las células11. Otros instrumentos automáticos que miden indirectamente el SCC son el Fossomatic 90, que funciona en base a citometría de disco, y el Fossomatic 5000 (Foss Electric, Hillerød, Dinamarca) que se basa en FCM. En FCM, se tiñe una suspensión de células y se hace pasar a través de un tubo capilar iluminado frente a un objetivo de microscopio. Luego, cada célula que pasa es registrada por el dispositivo fotoelectrónico adjunto al microscopio. Sin embargo, las máquinas basadas en FCM son muy caras y sólo pueden utilizarse en el laboratorio. El contador de células DeLaval (DeLaval, Tumba, Suecia) es un instrumento analítico portátil para contar células somáticas de forma óptica y automática. Este método adolece de un alto coeficiente de variación y una baja repetibilidad12.

Hoy en día, la tecnología de microfluidos puede analizar con precisión los resultados del estado de la mastitis. Los dispositivos de microfluidos son herramientas poderosas para detectar e identificar partículas biológicas de muestras, especialmente patógenas. Se han propuesto varios tipos de microfluidos para la detección bacteriana clínica. Por ejemplo, se analizaron la sangre y la orina de un ser humano utilizando un dispositivo de microfluidos; la bacteria E. coli fue separada de sus glóbulos rojos en altas concentraciones celulares13. Se utilizó una plataforma de microfluidos para identificar múltiples bacterias patógenas que contribuyeron a las infecciones del tracto urinario; la precisión de los resultados fue superior al 90%14,15. Además, se aplicó un microscopio de campo oscuro automatizado para identificar y cuantificar simultáneamente bacterias patógenas. Se inmovilizaron bacterias patógenas vivas directamente de las muestras clínicas en menos de 4 h tanto para la preparación de las muestras como para la recopilación de datos16. Estos dispositivos también pueden medir simultáneamente el tamaño de cada bacteria17. Muy recientemente, se han propuesto dos plataformas de microfluidos para separar bacterias de células sanguíneas en altas concentraciones celulares mediante acuustoforesis en silicio18 y chips de microfluidos de plástico19, lo que permite que los rendimientos sean lo suficientemente altos para muchas tareas clínicas20. Sin embargo, estas plataformas dependen de un hardware de gran tamaño para gestionar el control de flujo y carecen de capacidades de detección rápida.

En consecuencia, investigamos para desarrollar un nuevo dispositivo de microfluidos que permita un análisis simple de los resultados basado en un enfoque de laboratorio en un chip. El chip de microfluidos se diseñó con tres partes: un filtro, un mezclador y un detector, lo que permitió el flujo unidireccional de la muestra sin ninguna obstrucción durante la prueba. Las células somáticas se filtraron para lograr un rango de tamaño de 10 a 30 μm y luego se tiñeron con naranja de acridina (AO). Las células somáticas se alinearon dentro de un microcanal para permitir un control preciso del posicionamiento y la orientación de las células aguas abajo en el área de detección, que se integró con fibra óptica para la medición de la fluorescencia. Este dispositivo se puede utilizar para identificar células somáticas en la leche cruda de vaca midiendo la fluorescencia emitida por las células cuando se excitan con una longitud de onda de luz específica. La señal de fluorescencia se puede utilizar para distinguir las células somáticas de otros tipos de células e identificar el estado de mastitis en la leche. Los resultados mostraron que el dispositivo puede realizar análisis con una precisión de hasta el 95% en comparación con la máquina Fossomatic.

Esta investigación clasificó la muestra de leche cruda en tres grupos basándose en tres métodos experimentales: CMT, Fossomatic y el método propuesto (miniespectroscopia). Los grupos se etiquetaron como normales, subclínicos y clínicos utilizando los métodos CMT y Fossomatic con fines de comparación. Los resultados de la comparación eran necesarios para demostrar la eficacia del método propuesto y proporcionar una referencia para la base de datos.

Los resultados de CMT revelaron cinco clases posibles según el gel formado por la mezcla entre la leche y el reactivo CMT: 0 (negativo), 1 (traza +), 2 (positivo débil ++), 3 (positivo distinto +++) y 4 (fuerte positivo ++++). El método Fossomatic clasificó la leche según el recuento estimado de células somáticas (SCC), con la leche por debajo de 200 000 células/mL etiquetada como premium, la leche entre 200 000 y < 350 000 células/mL etiquetada como buena y la leche entre 350 000 y 500 000 células/mL. etiquetado como estándar21. Los conjuntos de datos se recopilaron para interpretar los resultados obtenidos con los dispositivos CMT y Fossomatic. Sin embargo, se observaron grandes discrepancias en la interpretación, particularmente entre los grados 1 y 2 y entre los grados 3 y 4. Como resultado, se añadió a la muestra un segundo grupo de etiquetas. Las muestras clasificadas como trazas o positivos débiles se agruparon bajo la etiqueta "subclínica", las muestras clasificadas como positivos distintivos o positivos fuertes se agruparon bajo "clínica" y las muestras clasificadas como negativas se agruparon bajo "normal". Esta clasificación se correlacionó con el número de células somáticas en la leche. La leche con un recuento de células somáticas inferior a 200 000 células/ml se etiquetó como normal, la leche con un recuento entre 200 000 y 500 000 células/ml se etiquetó como subclínica y la leche con un recuento superior a 500 000 células/ml se etiquetó como clínica. La Tabla 1 presenta la distribución de instancias por clase e interpretaciones. Los resultados indicaron que la prevalencia de mastitis observada en este estudio fue similar a la reportada en investigaciones anteriores en esta área22.

El dispositivo de microfluidos y el método de la cubeta se evaluaron utilizando permanganato de potasio (KMnO4) como sustancia estándar para comparación. La capacidad del dispositivo para analizar la leche se probó en los modos de absorbancia, transmitancia y fluorescencia, y se utilizó colorante AO en la prueba de fluorescencia. La Figura 1a muestra la absorbancia máxima de KMnO4 durante un intervalo de tiempo, junto con su desviación positiva y negativa de la absorbancia promedio a 523/10 nm23. La Figura 1b muestra los espectros de emisión de fluorescencia de una célula marcada con AO, que se midió usando un espectrómetro para registrar el espectro de luz emitida a 525/50 nm24. Se preparó una solución de KMnO4 a una concentración de 10 a 45 mg/dm3 y también se prepararon soluciones de 100 µg/mL de sal hemi (cloruro de zinc) de AO (A6014, Sigma-Aldrich).

Espectros de emisión de sustancias: (a) solución estándar de permanganato de potasio y (b) solución estándar de AO.

Se recolectaron muestras de leche cruda de 5 vacas Holstein ubicadas en el norte de Tailandia. Se obtuvo un total de 100 mL de leche cruda en 1 día y se almacenó en refrigerador a menos de 4 °C durante 1 día después del ordeño para preservar su calidad. Las muestras se sacaron del refrigerador 60 minutos antes de la medición y se dejaron alcanzar una temperatura de 37 °C. Para asegurar que los componentes de las muestras fueran uniformes, se agitaron a 40 °C en un baño de agua25.

La Figura 2 ilustra el sistema de espectroscopia empleado para adquirir los espectros de fluorescencia. El sistema constaba de un espectrómetro Exemplar (B&W Tek, Inc., EE. UU.) con un rango de longitud de onda de 350 a 1050 nm, una cubeta de cuarzo con una trayectoria óptica de 2 mm que servía como conjunto de muestras (Yehui Instrument Ltd. Co., China). , un depósito de muestra (BCH103A B&W Tek, Inc., EE. UU.), una fuente de luz (BPS101 B&W Tek, Inc., EE. UU.) y fibras ópticas de 100 µm (Ocean Optics, Inc., FL). El estándar de prueba se ejecutó en una computadora portátil (Fig. 1a), mientras que un sistema de microfluidos reemplazó la cubeta de cuarzo (Fig. 1b).

Sistema utilizado para la obtención de los espectros de fluorescencia. Análisis de leche bajo (a) sistema estándar (b) chip de microfluidos (c) configuración experimental para clasificar células somáticas bajo un dispositivo estándar (cubeta) y (d) configuración experimental para clasificar células somáticas bajo un dispositivo de microfluidos.

Se utilizaron fibras ópticas para conectar la fuente de luz, el depósito de muestra y el espectrómetro. Se prepararon muestras de leche cruda mezclándolas con AO en una proporción de 10:1 e inyectándolas en cubetas de cuarzo utilizando micropipetas. Las cubetas se llenaron con leche diluida y se colocaron en el depósito de muestra. Los espectros de fluorescencia de las muestras se recolectaron en un rango de longitud de onda de 350 a 1050 nm utilizando el software BWSpec, con un tiempo integral de 300 ms, un número promedio de 5 y un número de suavizado de 0. Se crearon cinco réplicas para cada muestra. y el valor medio se calculó como resultado del sistema estándar.

Para el análisis de la leche cruda utilizando el sistema de chip de microfluidos, la fuente de luz, el sistema de microfluidos y el espectrómetro se conectaron mediante fibras ópticas. La leche cruda se inyectó en el sistema de microfluidos a un caudal de 100 µL/min usando una bomba de jeringa, y los espectros se recolectaron usando el software BWSpec, con el mismo tiempo integral, número promedio y número de suavizado que para el sistema estándar. . Se crearon cinco réplicas para cada muestra y el valor medio se calculó como resultado del sistema de microfluidos.

Para garantizar datos espectrales de alta calidad y minimizar el impacto del ruido ambiental y el consumo de energía, el sistema se estabilizó encendiéndolo durante aproximadamente 30 minutos antes de cada experimento. Durante este período, se permitió que el instrumento alcanzara su temperatura de funcionamiento. Para proporcionar una corriente constante y una alta eficiencia de la lámpara halógena de tungsteno, se utilizó para la medición del miniespectrómetro la fuente de luz halógena de tungsteno BPS101 que requirió un período de calentamiento. Por lo tanto, era necesario dejar suficiente tiempo de calentamiento para que la lámpara alcanzara un valor estable de alrededor de 20 lúmenes por vatio, que es comparativamente más alto que otros tipos de lámparas incandescentes.

A continuación, se recopilaron espectros de referencia blancos y oscuros para el experimento. El espectro de referencia oscuro (FD) se obtuvo apagando la fuente de luz y utilizando una campana opaca. Mientras tanto, el espectro de referencia blanco (FW) se obtuvo midiendo los datos sin procesar del agua desionizada (DI). Los espectros recopilados de las muestras de leche se designaron como SP_1. Los espectros de absorbancia originales calibrados, TC, se calcularon utilizando la ecuación. (1):

Luego se calibraron los espectros de absorbancia al 100% de transmisión (T) con agua destilada a la longitud de onda máxima (λmax). Los espectros calibrados (TC) se utilizaron en análisis adicionales, como el preprocesamiento espectral, la reducción de la dimensión de los datos y el modelado.

Con respecto al proceso de prueba de aparatos de fluidos para análisis espectral, se diseñaron tres experimentos para confirmar la capacidad analítica del dispositivo de microfluidos propuesto.

El experimento 1 probó un dispositivo estándar (cubeta) frente a un dispositivo de microfluidos para demostrar que los valores de la muestra se pueden medir mediante análisis espectroscópico. Se realizaron tres modos de prueba, que incluyeron modos de absorbancia, transmitancia y fluorescencia. Las muestras utilizadas para las pruebas fueron una solución estándar de permanganato de potasio para los modos de absorbancia y transmitancia, y una solución de fluoresceína 0,01 M para el modo de fluorescencia. La solución de fluoresceína pudo emitir luz en el rango de longitud de onda de 518 a 520 nm.

El experimento 2 se realizó para probar la capacidad del dispositivo de microfluidos para analizar la leche mediante espectroscopia. El experimento se dividió en varias pruebas, incluidas pruebas de absorción de luz y pruebas de transmisión de luz que comparan la leche con permanganato de potasio, y pruebas de fluorescencia utilizando muestras de fluoresceína, AO y leche mixta AO. Además, el estudio empleó una cubeta para comparar los resultados del análisis de la prueba de fluorescencia entre el dispositivo de microfluidos y la cubeta y para evaluar las capacidades de análisis de leche del dispositivo de microfluidos.

El experimento 3 se realizó para probar varios tipos de muestras de leche utilizando un dispositivo de microfluidos y comparar los resultados con las mediciones obtenidas del Fossomatic. El propósito del experimento fue confirmar si el dispositivo de microfluidos era capaz de analizar diferencias en muestras de leche con tanta eficacia como el Fossomatic, que sirvió como referencia en la Tabla 1.

Las muestras de leche se analizaron teñiéndolas con AO en una proporción de 1:10. AO tiene una longitud de onda máxima de excitación de 502 nm y una longitud de onda máxima de emisión de 525 nm, lo que produce una fluorescencia verde. La AO es un colorante que se une a ácidos nucleicos y que puede penetrar en las células y unirse al ADN o al ARN, emitiendo fluorescencia roja. Esta propiedad única hace que el AO sea útil para estudiar el ciclo celular, ya que puede interactuar con el ADN o el ARN mediante interferencia o atracción electrostática. El proceso de unión es similar para el ADN y el ARN, lo que da como resultado un espectro de fluorescencia similar. Como resultado, la AO se puede utilizar para obtener imágenes de lisosomas y fagolisosomas primarios, que pueden contener sus productos. Para la fagocitosis de células apoptóticas, el teñido se realiza comúnmente bajo un microscopio de epifluorescencia y FCM. Las tinciones AO son particularmente útiles para la detección rápida de muestras esterilizadas de forma rutinaria y, por lo tanto, se recomiendan para la detección microscópica de microorganismos fluorescentes en frotis directos preparados a partir de materiales clínicos y no clínicos. La tinción se debe realizar a un pH ácido de 5,5 para lograr un efecto de tinción diferente para las bacterias, lo que da como resultado manchas anaranjadas, mientras que los componentes del tejido aparecerán de amarillo a verde.

El diseño del chip de microfluidos se creó utilizando Layout Editor@. El microcanal se desarrolló como una estructura tres en uno para filtrar, mezclar y detectar linfocitos en la leche cruda de vaca, como se muestra en la Fig. 3. Las células de linfocitos oscilaban entre 7 y 18 µm y constituían el 40 % de la leche cruda. Los linfocitos se filtraron a través del filtro de la estructura y luego se mezclaron con tinción AO, que se une al ADN/ARN en las células somáticas. La tinción se realizó a un pH ácido para lograr una tinción diferencial, donde las bacterias mostraron manchas de color naranja y los componentes del tejido mostraron manchas de amarillo a verde. Luego se detectaron linfocitos en una estructura unicelular (Estructura 3) utilizando un miniespectrómetro. La Estructura 1 tenía tres capas que filtraban linfocitos de tamaños 100, 50 y 20 µm. Todo el chip de microfluidos se fabricó mediante fotolitografía y se colocó sobre una oblea de vidrio mediante rayos X y litografías suaves. El proceso de microfabricación se ilustra en la Fig. 4. Para crear la máscara de rayos X, se empleó litografía de escritura directa con láser UV. Se depositó una máscara de Cr estampada usando Ti/Cr/Ti sobre el sustrato de vidrio, y se recubrió por rotación el fotoprotector AZ P1518 sobre este sustrato. Luego, el patrón escrito con luz UV directa sobre el sustrato se expuso a una dosis de UV de aproximadamente 68 mJ/cm2. El sustrato de vidrio se desarrolló alrededor de la máscara de Cr estampada y se grabó Ti/Cr/Ti. El fotorresistente AZ P1518 se eliminó usando una solución de acetona y la máscara de Cr estampada apareció en el sustrato. La máscara de rayos X se fabricó sobre un sustrato de grafito, que se recubrió con láminas secas de SU-8 de 20 µm de espesor expuestas a una dosis de UV de 50 mJ/cm2. El sustrato de grafito se modeló para la máscara de Cr y se galvanizó para el recubrimiento de una película de Au sobre el sustrato de grafito estampado. La máscara de rayos X de grafito con patrón de Au tenía un espesor de aproximadamente 20 µm para someterse a litografía de rayos X. La exposición a rayos X se realizó sobre las láminas de SU-8 a una dosis mínima de 100.000 mJ/cm3 para lograr un espesor de 200 µm para las láminas. Para proporcionar interconexiones fluídicas de entrada y salida, se utilizó un polidimetilsiloxano replicado Sylgard 184 (PDMS-184) como réplica del molde maestro. Este molde PDMS tenía un patrón de microcanales debajo y los patrones se unieron mediante el método de plasma O2. El microdispositivo se conectó a la fibra óptica y se conectó mediante el método de miniespectrometría para configurar la conexión de microcanal para el experimento.

Estructura del microcanal para clasificar y contar células somáticas (estructura tres en uno). La Estructura 1 es el Sistema de Filtro de Células Somáticas, que filtra los linfocitos con un tamaño de 7 a 18 µm y los neutrófilos con un tamaño de 10 a 15 µm, lo que representa del 70 al 95% del total de células somáticas en la leche26. La Estructura 2 es el Sistema de Mezcla, que mezcla las células somáticas filtradas de la Estructura 1 con colorante AO. La AO se utiliza normalmente para teñir la membrana de las células somáticas, que tiñe el ADN cuando se observa con un microscopio. La fluorescencia emitida en el máximo de emisión fue de 525 nm (verde). Este sistema no requiere un tiempo de incubación de hasta 30 min para que el tinte se adhiera al ADN. La mezcla se realiza utilizando un esquema de mezcla combinado con un control de flujo adecuado. Luego se analiza la mezcla resultante de tinte y células somáticas utilizando una tercera estructura. La tercera estructura organiza las capas de células somáticas para formar una sola capa, que se analiza utilizando un miniespectrómetro para lectura espectral utilizando principios de fluorescencia. Se diseña una estructura de cableado de fibra óptica con un ángulo de 90° para leer los valores de fluorescencia, permitiendo analizar las diferencias entre cada tipo de leche.

El proceso de fabricación de chips de microfluidos utilizados para clasificar y detectar células somáticas. (a) Se fabrica una máscara de Cr mediante litografía de escritura directa con láser. (b) Se crea una máscara de rayos X sobre un sustrato de grafito y luego se expone mediante litografía de rayos X en un fotoprotector SU-8 de 200 µm de espesor. (c) El patrón de microcanales se aplica al PDMS replicado para crear el chip de microfluidos.

El dispositivo de microfluidos se conectó al miniespectrómetro para medir la absorbancia, transmitancia y fluorescencia de la sustancia estándar con el fin de determinar la precisión del dispositivo de microfluidos en comparación con el dispositivo estándar (Cubeta) (que se muestra en la Fig. 2c, d). . Se controló que la leche cruda y el tinte AO fluyeran hacia el dispositivo a una velocidad de 45 µL/min y 15 µL/min, respectivamente, como se muestra en la Fig. 5. La lámpara BPS101 se ajustó para lograr una intensidad de 35 000. Se utilizaron tiempos de análisis de muestras de 100 ms y 300 ms para el modo de absorbancia, transmitancia y fluorescencia, respectivamente.

Dispositivo microfluídico para clasificación de células somáticas. (a) Dispositivo de microfluidos (b) filtro de células somáticas (c) mezclador de células somáticas (d) alineación de células somáticas con el área de detección (e) Área de detección.

La calidad de la leche se midió mediante un fotoespectrómetro que funciona según el principio de la luz. Se utilizaron dos tipos de equipos: el equipo estándar (Cuvette) y el dispositivo de microfluidos propuesto, como se muestra en las Figs. 6 y 7, y se compararon sus precisiones de medición.

Los resultados de probar la concentración de permanganato de potasio (KMnO4) en la cubeta. (a) Modo de absorbancia (b) modo de transmitancia y (c) Fluoresceína 0,01 M para el modo de fluorescencia (d) Precisión analítica de la cubeta para permanganato de potasio en modo de absorción.

Los resultados de la prueba de la concentración de permanganato de potasio (KMnO4) en el dispositivo de microfluidos. (a) Modo de absorbancia (b) modo de transmitancia y (c) Fluoresceína 0,01 M para modo de fluorescencia (d) Precisión analítica de un chip de microfluidos para permanganato de potasio en modo de absorción.

Se utilizó la técnica óptica del fotoespectrómetro para examinar los resultados de la calidad de la leche. Esta técnica analiza la absorbancia, transmitancia y fluorescencia de una solución, lo que puede determinar sus propiedades. La prueba se llevó a cabo utilizando permanganato de potasio como sustancia estándar para el modo de absorbancia y transmitancia para demostrar la funcionalidad de la cubeta y el chip de microfluidos, con los resultados que se muestran en las Figs. 6a,b y 7a,b, respectivamente. Se utilizó permanganato de potasio, que tiene una longitud de onda espectral máxima de 525 nm, para determinar la capacidad del dispositivo para realizar un análisis en los modos de absorbancia y transmitancia. En modo de fluorescencia, la prueba se llevó a cabo utilizando una sustancia estándar de fluoresceína 0,01 M para demostrar la funcionalidad de la cubeta y el chip de microfluidos, y los resultados se muestran en las Figs. 6c y 7c. Se utilizó fluoresceína, que tiene una longitud de onda espectral máxima de 518 nm, para determinar la capacidad del dispositivo para realizar un análisis en modo de fluorescencia.

Además, realizamos un análisis para evaluar la precisión del dispositivo de microfluidos en modo de absorbancia en comparación con la cubeta, como se ilustra en las Figs. 6d y 7d. Los resultados indicaron que el dispositivo de microfluidos exhibió un valor de r cuadrado confiable de 0,9642, mientras que la cubeta tenía un valor de r cuadrado de 0,9877, con una diferencia de varianza de solo 0,0235. Este experimento muestra que el dispositivo de microfluidos se puede probar mediante espectroscopia y proporcionar una precisión comparable a la del soporte de cubeta estándar.

El experimento posterior implicó probar la leche en un chip de microfluidos, con pruebas realizadas en modos de absorción, transmisión y fluorescencia. Los modos de absorción y transmisión se probaron utilizando una solución estándar de permanganato de potasio en comparación con la leche, y los resultados de la prueba se presentan en las figuras 8a y b. Se encontró que la cubeta de prueba no podía medir la leche mediante los modos de absorción y transmisión, aunque tales modos eran posibles para el permanganato de potasio. Mientras tanto, el modo de fluorescencia se probó utilizando fluoresceína, OA y leche mezclada con AO; Los resultados de la prueba se presentan en la Fig. 8c, lo que indica que el dispositivo de microfluidos es capaz de detectar diferencias en la leche. Además, se comparó con la cubeta y los resultados se presentan en la Fig. 8d, lo que muestra que la cubeta no pudo analizar las diferencias. Este experimento demuestra así que el chip de microfluidos puede analizar la leche en modo fluorescente.

La prueba de leche y KMnO4 en el chip de microfluidos (a) modo de absorbancia y (b) modo de transmitancia. (c) Prueba de fluoresceína 0,01 M, AO y una mezcla de leche y AO en modo de fluorescencia de chip de microfluidos. (d) Prueba de fluoresceína 0,01 M, AO y una mezcla de leche y AO en el equipo estándar (cubeta). (e) comparación de la precisión con un dispositivo de microfluidos y un instrumento de conteo de células Fossomatic. La línea roja muestra la leche clínica, la línea amarilla muestra la leche subclínica y la línea verde muestra la leche normal.

Para evaluar el rendimiento del dispositivo de microfluidos en comparación con los resultados de referencia de CMT y Fossomatic, se realizó una prueba final. El dispositivo de microfluidos diseñado para leche cruda se analizó mediante un minifotoespectrómetro. Para este experimento, se supuso que las mediciones somáticas eran mediciones a nivel celular. Tanto el método CMT como el método habitual para analizar la leche cruda anormal demostraron la presencia de células somáticas en la leche. El reactivo CMT reaccionó con la leche cruda, lo que provocó la descomposición de las células hematopoyéticas, lo que dio como resultado una leche espesa y viscosa. El instrumento Fossomatic empleó el principio de medición FCM, que utilizaba un sistema de mezcla de flujo y tinte para proporcionar una medición célula por célula. Para medir ópticamente los atributos a nivel celular, las mediciones de la cubeta tuvieron que reducirse a un tamaño más cercano al de las células somáticas. Para lograr esto, se diseñó un sistema de microfluidos para transportar un grupo de células a un área de inspección con haz de tamaño similar al de las células. Finalmente, las células somáticas fueron transportadas al área de análisis, donde los resultados fueron analizados mediante un miniespectrómetro. El análisis de la leche fue diseñado para los modos de absorbancia de luz, transmitancia y fluorescencia. La Figura 8e muestra los resultados del análisis, que se compararon con la precisión del análisis realizado con la máquina Fossomatic, arrojando una precisión de hasta el 95 %, como se muestra en la Tabla 2.

Sin embargo, los componentes del chip diseñado todavía tenían algunas desventajas. Aunque el microfiltro podía filtrar células somáticas de menos de 50 µm de tamaño y solo permitir que estas células pasaran a través de la sección de mezcla, las partículas más grandes que estaban bloqueadas al principio disminuyeron el caudal y podrían haber causado un desequilibrio en la concentración entre las células somáticas. muestra y el tinte. Las partículas grandes inicialmente bloqueadas pueden reducir el caudal y provocar una concentración desigual entre la muestra y el tinte. Además, el bloqueo hace que el dispositivo de microfluidos se obstruya después de 10 minutos, lo que significa que sólo se puede utilizar durante menos de 10 minutos. Los investigadores planean superar estas desventajas diseñando un sistema de eliminación de células somáticas de más de 50 µm para evitar los problemas antes mencionados.

Se ha diseñado y fabricado un dispositivo analítico de microfluidos que utiliza el principio de un miniespectrómetro para detectar un recuento elevado de células somáticas en la leche. El dispositivo de microfluidos puede analizar anomalías en los modos de fluorescencia, caracterizando así las infecciones de la leche a través de diferentes curvas espectrales. La magnitud de fluorescencia de la leche infectada con recuentos somáticos elevados fue mayor que la de la leche normal sin células somáticas. Los resultados experimentales del dispositivo de microfluidos fueron consistentes con los del dispositivo Fossomatic estándar, verificando la exactitud de las mediciones con hasta un 95% de precisión. Por lo tanto, el dispositivo de microfluidos podría detectar tendencias de mastitis en vacas comparables a las del dispositivo Fossomatic. Estos resultados pueden utilizarse para crear un dispositivo prototipo capaz de detectar la presencia de mastitis dentro del espectro.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio no están disponibles públicamente debido al impacto en las industrias de leche de vaca en nuestro país, pero están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Departamento de Ciencias Animales y Acuáticas, Facultad de Agricultura, Universidad de Chiang Mai, Chiang Mai, 50200, Tailandia

Trisadee Khamlor

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CP, KL y RP son el investigador principal y escribieron el manuscrito principal. WN y TK son el apoyo de las instalaciones y el asesor de análisis.

Correspondencia a Komgrit Leksakul.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Phiphattanaphiphop, C., Leksakul, K., Nakkiew, W. et al. Fabricación de chips de microfluidos espectroscópicos para la detección de mastitis en leche cruda. Representante científico 13, 6041 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33258-0

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Recibido: 06 de diciembre de 2022

Aceptado: 10 de abril de 2023

Publicado: 13 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33258-0

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