ácido nucleico peptídico

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14222 (2023) Citar este artículo

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Los portadores de medicamentos ideales presentan una alta capacidad de carga para minimizar la exposición de los pacientes a materiales portadores inactivos y excesivos. La mayor capacidad de carga imaginable podría lograrse mediante nanoportadores, que se ensamblan a partir de las propias moléculas de carga terapéuticas. Aquí, describimos nanopartículas de coordinación de circonio (Zr) basadas en ácido peptídico nucleico (PNA) que exhiben una carga de PNA muy alta de \(>\,94\%\) p/p. Esta clase de nanomateriales híbridos organometálicos extiende el enorme espacio compuesto de los polímeros de coordinación hacia conectores de oligonucleótidos bioactivos. La arquitectura de los PNA monocatenarios o bicatenarios se varió sistemáticamente para identificar criterios de diseño para el autoensamblaje impulsado por coordinación con nodos de Zr (IV) a temperatura ambiente. Las funciones de los ácidos carboxílicos aromáticos, que actúan como bases de Lewis, y un proceso de síntesis de dos pasos con preformación de \(Zr_{6} O_{4} (OH)_{4}\) resultaron ser decisivos para el ensamblaje exitoso de nanopartículas. La microscopía de barrido láser confocal confirmó que las células internalizan fácilmente las nanopartículas de PNA-Zr. Las nanopartículas de PNA-Zr, recubiertas con un lipopéptido catiónico, administraron con éxito una secuencia de PNA antisentido para la corrección del empalme de la mutación del intrón de \(\beta\)-globina IVS2-705 en una línea celular indicadora funcional y mediaron el cambio de empalme mediante la interacción con el Maquinaria de empalme de ARNm endógeno. Las nanopartículas de PNA-Zr presentadas representan una plataforma bioactiva con alta flexibilidad de diseño y extraordinaria capacidad de carga de PNA, donde el ácido nucleico constituye una parte integral del material, en lugar de cargarse en sistemas de administración pasiva.

Las estructuras metal-orgánicas (MOF) son materiales híbridos inorgánicos-orgánicos compuestos de iones metálicos o grupos de metales y conectores orgánicos con funciones de base de Lewis. El autoensamblaje impulsado por la coordinación de los enlazadores orgánicos y los nodos metálicos conduce a la creación de estructuras bidimensionales o tridimensionales altamente ordenadas, en muchos casos porosas1,2. Aunque los MOF son estructuras abrumadoramente cristalinas, en la literatura se informa sobre MOF no cristalinos, como MOF amorfos, líquidos de MOF, vidrios de MOF y otros polímeros de coordinación3. La estrategia de ensamblaje versátil permite la creación de materiales híbridos con una variedad de características seleccionando unidades de construcción adecuadas4. Esta flexibilidad de diseño crea un enorme espacio compuesto con una gran cantidad de MOF generados y polímeros de coordinación para diversos propósitos5,6,7,8. En el contexto de las aplicaciones biomédicas, los MOF y los polímeros de coordinación se han diseñado como portadores de fármacos o biomoléculas moleculares pequeñas, así como estructuras con propiedades de fotosensibilización, mejora de la radiación y de bioimagen9,10,11,12,13,14. 15,16,17. UiO-66, construido a partir de grupos de óxido de circonio hexanuclear \((Zr_6 O_4 (OH)_4)\) y ácido tereftálico (TPA), pertenece al conjunto de MOF más investigados18,19. Debido a la síntesis sencilla, la estabilidad excepcional y la superficie muy alta, el UiO-66 y sus derivados también se evaluaron con frecuencia para su utilización como portadores de fármacos20. Un parámetro generalmente crítico para la aplicación de nanofármacos está representado por la toxicidad potencial del material. En el caso de los MOF, se debe tener en cuenta la tolerabilidad de los componentes individuales, así como la nanotoxicidad de las partículas ensambladas21. El Zr está presente en sistemas biológicos y tiene una toxicidad moderadamente baja, como se encontró en estudios histológicos y citológicos22. Los MOF basados ​​en Zr generalmente poseen una baja toxicidad relacionada con el componente metálico, aunque los grados de biocompatibilidad pueden variar dependiendo de los componentes del conector orgánico y las estructuras individuales23,24. Una estrategia para superar algunos problemas de toxicidad es la utilización de ligandos orgánicos endógenos bien tolerados, como aminoácidos25,26,27, péptidos28,29,30, proteínas31,32 o nucleobases33,34 para la generación de "Bio-MOF"35. 36. Sin embargo, incluso en el caso de nanomateriales bien tolerados, una alta capacidad de carga del fármaco y una exposición mínima de los pacientes a un exceso de material portador son favorables para prevenir reacciones adversas. En teoría, la carga máxima de fármaco podría lograrse mediante nanomateriales formados por las propias entidades bioactivas. Los nanofármacos organometálicos construidos a partir de moléculas de fármacos con funciones de base de Lewis que se ensamblan en nanopartículas de coordinación con iones metálicos se aproximan a los nanoportadores previstos con una capacidad de carga máxima37,38. Si bien este concepto ya se ha realizado con productos terapéuticos de bajo peso molecular39,40,41,42, no se han informado polímeros de coordinación que contengan conectores basados ​​en biomoléculas bioactivas o análogos sintéticos.

Las estrategias informadas anteriormente para la generación de ácido nucleico que contenía MOF se basaban principalmente en la unión a superficies de MOF internas o externas y en la biomineralización durante el ensamblaje de MOF. Se han utilizado interacciones covalentes y no covalentes para funcionalizar MOF con oligonucleótidos43. Por ejemplo, el MOF UiO-66-N3 de circonio, que contiene conectores orgánicos con un grupo azido, se funcionalizó covalentemente con oligonucleótidos de ADN modificados con dibenzociclooctina (DBCO) mediante una reacción de clic promovida por cepa10. Además, se utilizó UiO-68 que contenía ácido aminotrifenildicarboxílico como ligando para la unión no covalente del ARNip a la superficie44. De manera similar, los MOF de circonio, NU-1000 y PCN-222/MOF-545, se funcionalizaron con oligonucleótidos terminados en fosfato mediante interacciones coordinativas45. Independientemente del modo de interacción individual, los parámetros críticos para la incorporación de oligonucleótidos en las cavidades internas son las dimensiones de los poros que determinan la accesibilidad a la matriz MOF interna46,47. Alternativamente, se han encapsulado biomoléculas grandes, incluidos ácidos nucleicos, en MOF mediante biomineralización durante el ensamblaje de la estructura48,49. En todos estos casos, los oligonucleótidos representan moléculas invitadas en distintos materiales MOF. Por el contrario, hasta ahora no se ha realizado el uso de ácidos nucleicos como componentes estructurales esenciales, aunque se sugiere que es favorable para aumentar la capacidad de carga y simplificar la fabricación. Los ácidos nucleicos peptídicos (ANP) son análogos de ácidos nucleicos sintéticos que contienen una estructura peptídica de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina con nucleobases unidas mediante conectores carbonilmetileno50. Al igual que los ácidos nucleicos naturales, los PNA se unen con alta afinidad y especificidad a secuencias complementarias de ADN, ARN o PNA. De hecho, las afinidades y fuerzas de unión de los dúplex complementarios de PNA-PNA, PNA-DNA o PNA-RNA son mayores y se ven menos afectadas por el estrés iónico que los dúplex de secuencias análogas de ADN o ARN51,52. Los PNA representan una poderosa tecnología de ácidos nucleicos sintéticos debido a (1) su capacidad de unión fuerte y estable, (2) buena discriminación de secuencias no coincidentes, (3) accesibilidad y flexibilidad sintéticas y (4) resistencia a la degradación por nucleasas y proteasas53,54. 55. Además de aplicaciones bioanalíticas como sondeo de ácidos nucleicos, hibridación in situ y modulación por PCR56,57,58,59. Los PNA pueden funcionar como oligonucleótidos antisentido para silenciar la expresión génica o modular el empalme del ARNm celular60,61. Al igual que otras químicas nucleicas, la administración celular representa un desafío importante para las aplicaciones antisentido de los PNA. A pesar de la carga neutra y el carácter lipófilo, los PNA no cruzan la membrana celular de manera eficiente. Por esta razón, los PNA se conjugaron con péptidos que penetran en las células, se formularon en sistemas de administración o se modificaron químicamente para permitir la entrada celular62,63,64,65. Aquí presentamos nuevos tipos de nanopartículas de coordinación organometálicas basadas en enlazadores de PNA y circonio (IV) (nanopartículas de PNA-Zr). Hasta donde sabemos, el material presentado es el primer ejemplo de polímeros de coordinación construidos a partir de análogos de ácidos nucleicos como componente conector orgánico. Para su aplicación como nanoportador, las nanopartículas de PNA-Zr presentan una capacidad de carga muy alta, las células las internalizan fácilmente y pueden transportar PNA funcionales para la corrección del empalme mediante interferencia específica de secuencia con los procesos de empalme de ARNm endógeno.

El diseño y selección de enlazadores orgánicos adecuados es un paso clave en la síntesis de MOF e impacta de manera crítica las propiedades y características de MOF después del ensamblaje. Los enlazadores requieren funciones de base de Lewis que contienen átomos donantes de N u O, como ácidos carboxílicos o N-heterociclos aromáticos. La mayoría de los enlazadores MOF establecidos poseen una estructura rígida con flexibilidad restringida debido a enlaces, ciclos o arenos insaturados que conectan las funciones de base de Lewis separadas. Con el fin de establecer una plataforma para la creación de nanopartículas de coordinación PNA-Zr, se diseñaron diferentes arquitecturas de enlazadores de PNA para imitar las características de los enlazadores MOF establecidos: (1) se unieron ácidos carboxílicos aromáticos en los extremos del PNA para proporcionar funciones de base de Lewis en posiciones distantes ; (2) se utilizaron PNA monocatenarios y bicatenarios para modular la rigidez del conector. Desafortunadamente, la mayoría de las síntesis de MOF comunes en condiciones solvotérmicas no son compatibles con los PNA bicatenarios, ya que los dúplex de PNA se funden y se disocian a las altas temperaturas requeridas. Por lo tanto, se tuvo que elegir una estrategia para la síntesis de MOF a temperatura ambiente (RT).

Proceso de síntesis de partículas, modificaciones de PNA y arquitecturas de enlazadores. (A) Síntesis de partículas de PNA-Zr mediante un proceso de dos pasos. (B) Modificaciones finales del PNA: ácido tereftálico izquierdo (TPA, rojo), ácido paraaminometilbenzoico central (PAMBA, verde) y ácido acético derecho (ACI, azul). (C) Arquitecturas de enlazador PNA. Creado con BioRender.com.

El laboratorio de Omar Farha desarrolló una síntesis RT de UiO-66, que se construye a partir de grupos de óxido de circonio hexanuclear \(Zr_6 O_4 (OH)_4\) y TPA66. En esta estrategia, la síntesis clásica de MOF solvotermal en un solo recipiente se analiza en los pasos secuenciales de (1) preformar unidades de construcción secundarias a partir de propóxido de circonio \(Zr(OnPr)_4\) a altas temperaturas en presencia de ácido acético excesivo, seguido de ( 2) adición del conector TPA e incubación a temperatura ambiente. Este trabajo sirvió de base para la adaptación hacia nanopartículas de coordinación de Zr con conectores PNA sensibles a la temperatura. La estrategia para la formación de partículas se ilustra en el Esquema 1A. De manera análoga al trabajo de DeStefano et al.66, las partículas de coordinación se forman en un proceso de dos pasos67. Primero, los nodos Zr se generan incubando una solución que contiene \(Zr(OnPr)_4\), DMF y ácido acético en \(130\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 2 h. Luego, la solución de nodos metálicos se enfría a temperatura ambiente y se añade a una solución de conector PNA en una relación molar de conector a Zr de 1:1. En el caso de conectores de PNA de doble cadena, se llevó a cabo un paso de recocido inicial (calentamiento a \(90\,^{\circ }\hbox {C}\), enfriamiento a temperatura ambiente) para garantizar la formación de dúplex antes de la síntesis de nanopartículas. La mezcla de ensamblaje se incubó durante 24 h a temperatura ambiente y las partículas de PNA-Zr formadas se aislaron como un precipitado blanco mediante centrifugación. Como se ilustra en el Esquema 1C, se diseñaron varios enlazadores de PNA con diferentes modificaciones; Se introdujeron modificaciones en los extremos del ácido para-aminometilbenzoico (PAMBA) y TPA en los extremos C- (PAMBA) y N- (TPA) de las secuencias de PNA para servir como funciones de ácido carboxílico aromático para interacciones coordinativas con nodos metálicos. Por el contrario, los extremos N acetilados (ACI) sirvieron como controles sin función de base de Lewis. La Tabla 1 resume las secuencias de PNA que se evaluaron y la capacidad de servir como conectores para la formación de partículas con nodos de Zr.

Es importante señalar que los enlazadores de PNA generalmente se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño sin aditivos ácidos en el disolvente, ya que se observó que las sales de HCl de los PNA afectan negativamente la formación de partículas. Las secuencias palindrómicas de PNA con modificación del extremo N (TPA o ACI), que se ensamblan en dúplex debido a la autocomplementariedad, sirvieron como modelos simples de conectores bicatenarios. La secuencia palindrómica más corta que formó partículas con nodos de Zr exhibió una longitud de 6 unidades de monómero de PNA, pero solo si el extremo N se modificó con TPA. Por el contrario, los 4 y 2 meros palindrómicos no formaron partículas independientemente de las modificaciones finales de TPA o ACI. Se sugiere que la baja temperatura de fusión de las secuencias de PNA más cortas es responsable de la falta de dimerización y de la formación de conectores con dos funcionalidades finales coordinativas68.

La observación de que la acetilación generalmente impidió la formación de partículas con nodos de Zr indica la necesidad de TPA como modificación del extremo de la base de Lewis. Consistentemente, la combinación de dos PNA complementarios, no palindrómicos de 6 unidades con TPA en los extremos N también fue capaz de formar partículas, pero era esencial una proporción molar exacta de 1:1 de ambos PNA. Las secuencias de PNA equipadas con dos sitios de coordinación de metales en los extremos N- (TPA) y C- (PAMBA) eran adecuadas para la formación de partículas, independientemente de si se usaba como dúplex con una hebra complementaria adicional (sin PAMBA y TPA) o como simple. enlazador trenzado solo. La combinación de una secuencia de PNA con un TPA en el extremo N y el PNA complementario sin modificación, lo que conduce a un PNA bicatenario con una sola función terminal de ácido carboxílico aromático, provocó una formación menor de material sólido. Las observaciones muestran que tanto los PNA monocatenarios como los bicatenarios son capaces de formar partículas de coordinación con nodos de Zr, pero se requieren dos funciones terminales de ácido carboxílico para producir cantidades sustanciales.

Las partículas de PNA-Zr obtenidas se caracterizaron mediante un conjunto de técnicas de caracterización fisicoquímica. El tamaño de las partículas, la morfología y la carga superficial se determinaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), dispersión dinámica de la luz (DLS) y dispersión electroforética de la luz (ELS). Las imágenes SEM representativas (Fig. 1) muestran partículas pequeñas (entre 150 y 250 nm de diámetro), en su mayoría esféricas, formadas con diferentes conectores de PNA. Las mediciones de DLS (Fig. S1 en el Material complementario electrónico, ESM) mostraron partículas más grandes con promedios z entre 500 y 1000 nm. La desviación puede explicarse por una alta sensibilidad del DLS hacia agregados y partículas más grandes, así como por el hecho de que el DLS detecta tamaños de partículas hidrodinámicas en solución, mientras que las mediciones SEM se llevan a cabo con muestras secas69. Las mediciones de dispersión de luz electroforética determinaron potenciales zeta negativos entre \(-5\) y \(-10\) mV.

Imágenes SEM representativas de nanopartículas PNA-Zr. Las secuencias de enlazadores de PNA individuales se especifican en la esquina superior izquierda de las imágenes. Se utilizó como referencia el TPA que condujo a la formación de UiO-66 (barras de escala = 3 \(\upmu\)m).

La estabilidad térmica de las partículas de PNA-Zr se investigó controlando la densidad óptica (400 nm) de suspensiones de nanopartículas expuestas a un gradiente de temperatura. En general, las mediciones de turbidez o dispersión de la luz se llevan a cabo en una longitud de onda del espectro visible que no se superpone con los máximos de absorción de los componentes individuales; Los PNA, al igual que otros análogos de ácidos nucleicos, tienen un máximo de absorción en el espectro UV a 260 nm70,71. Como se ve en la Fig. 2C, las partículas de PNA-Zr son estables a temperatura ambiente independientemente de la arquitectura del conector de PNA. A temperaturas más altas, las partículas formadas a partir de enlaces bicatenarios con modificación de TPA en ambas hebras se desmontan a temperaturas elevadas, lo que puede reconocerse como una caída de la densidad óptica. Una explicación razonable es que los dúplex de PNA se funden a temperaturas elevadas, lo que da como resultado el desmontaje de los conectores con función TPA en ambos extremos. Por el contrario, las partículas que contenían conectores con PAMBA y TPA en una sola hebra no mostraron una sensibilidad a la temperatura similar. Estos resultados sugieren dos características clave de las nanopartículas de PNA-Zr: (1) dos funciones de ácido carboxílico aromático, ubicadas en ambos extremos de los conectores de PNA, son esenciales; y (2) los conectores bicatenarios con funciones de ácido carboxílico aromático separadas en ambas cadenas son sensibles al desmontaje del conector mediante fusión dúplex. La estabilidad de las partículas de PNA-Zr en tampones biológicos, HEPES isohídrico (20 mM, pH 7,4), así como HBG isohídrico e isotónico (HEPES 20 mM, pH 7,4, 5% de glucosa), se investigó con el mismo enfoque (Fig. 2A, B). Se agregaron partículas de PNA-Zr a HBG o HEPES y se controló la densidad óptica a 400 nm a lo largo del tiempo. De manera similar a los resultados del estudio de estabilidad térmica, las partículas que contenían conectores con dos funciones de ácido carboxílico aromático en una sola cadena de PNA mostraron una mayor estabilidad, mientras que las partículas compuestas de conectores bicatenarios con modificaciones de TPA en cadenas separadas se disociaron.

Se utilizó difracción de rayos X (DRX) para dilucidar la presencia de cristalinidad en nanopartículas representativas de PNA-Zr construidas a partir de bicatenarias (GCATGA-TPA palindrómicas) o monocatenarias (PAMBA-CGTGAC-TPA no palindrómicas y PAMBA-CCTCTTACCTCAGTACA- TPA) enlazadores (Fig. S2 en el ESM). A diferencia de los reflejos característicos obtenidos con UiO-66, XRD no encontró indicios de cristalinidad de las nanopartículas de PNA-Zr; por lo tanto, se sugieren estructuras bastante amorfas de partículas de coordinación PNA-Zr. Una caracterización adicional mediante sorción de nitrógeno determinó un área de superficie de 300 m\(^{2}\)/g para nanopartículas de PNA-Zr construidas a partir de GCATGA-TPA y 36 m\(^{2}\)/g para nanopartículas de PAMBA- CGTGAC-TPA (Fig. S3, Tabla S3 en el ESM)72. La isoterma de absorción de PAMBA-CGTGAC-TPA mostró similitud con una isoterma de absorción de tipo II que indica una estructura no porosa o macroporosa, mientras que GCATGA-TPA no pudo asignarse a ningún tipo característico73,74.

A continuación, se determinó el contenido de Zr de las partículas de PNA-Zr mediante espectrometría de emisión de átomos de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES, Fig. 2D). Se determinó un contenido de 52 mg/g de Zr para las partículas de PAMBA-CGTGAC-TPA y de 31 mg/g de Zr para las partículas de PAMBA-CGTGAC-TPA. Zr para partículas GCATGA-TPA, que refleja un contenido muy alto de PNA de 94,8% o 96,9%, respectivamente. Con base en los resultados obtenidos y los pesos moleculares de los conectores de PNA, se calculó la estequiometría de los componentes en el conjunto de partículas. Se determinaron concentraciones de Zr a enlazador de alrededor de 1,2:1 para ambos tipos representativos de nanopartículas de PNA-Zr, que está cerca de la proporción de 1:1 informada para UiO-6618.

Estabilidad de partículas de PNA-Zr e ICP-AES. Estabilidad de las partículas de PNA-Zr determinada mediante la medición de la densidad óptica (400 nm) después de la incubación en (A) HBG, (B) HEPES o (C) a temperaturas elevadas. Las arquitecturas de enlazadores de PNA se indican mediante colores (ver leyenda a continuación) (D) Contenido de Zr de partículas de PNA-Zr determinado por ICP-AES y relaciones molares resultantes calculadas teniendo en cuenta el peso molecular de los enlazadores.

El colorante fluorescente calceína, que contiene funciones básicas de Lewis y puede formar quelatos con iones metálicos, se utilizó para marcar partículas de PNA-Zr mediante interacción coordinativa42,75. Para ello, se incubaron partículas de PNA-Zr con una solución acuosa de calceína (0,25 mM) a temperatura ambiente. Al final del procedimiento de etiquetado, se observó un claro cambio de color de partículas blancas a naranjas (Fig. 3A). La comparación directa de partículas de PNA-Zr marcadas y no marcadas en el ensayo de estabilidad establecido confirmó que la carga de calceína no afectó la característica de estabilidad en HBG (Fig. 3B). Las partículas de PNA-Zr cargadas con calceína basadas en GCATGA-TPA se degradaron en 1 h en HBG, mientras que las partículas de PAMBA-CGTGAC-TPA no mostraron un desmontaje significativo de partículas. Además, se comparó la apariencia nanoscópica de las partículas de PNA-Zr marcadas y no marcadas mediante imágenes SEM. Como se ve en la Fig. 3D, E, la carga de calceína no afectó significativamente el tamaño y la forma de las partículas. Las mediciones de ELS (Fig. 3C) indicaron un ligero aumento del potencial zeta tras la carga de calceína, pero la carga general de las nanopartículas permaneció negativa. Los resultados que muestran propiedades de partículas no afectadas fueron requisitos esenciales para la siguiente determinación de la captación celular mediante imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de nanopartículas de PNA-Zr cargadas con calceína (Fig. 3F).

Las células HeLa pLuc/705 se incubaron durante 4 h con partículas marcadas basadas en conectores GCATGA-TPA palindrómicos bicatenarios o PAMBA-CGTGAC-TPA monocatenarios, seguido de un cambio de medio y una incubación adicional de 4 h. Las imágenes CLSM mostraron que ambos tipos de nanopartículas de PNA-Zr fueron internalizadas por las células, mientras que la calceína libre en la concentración correspondiente a la carga máxima de partículas no pudo detectarse intracelularmente. Esto indica que las nanopartículas de PNA-Zr son adecuadas para el transporte intracelular de compuestos impermeables y que las partículas no se disociaron en el medio de cultivo celular.

Partículas cargadas de calceína (A) Imágenes representativas de partículas de PNA-Zr antes y después de la carga de calceína. (B) Estabilidad de partículas de PNA-Zr cargadas y sin marcar con calceína en HBG determinada mediante medición de la densidad óptica (400 nm). (C) Potencial Zeta de partículas cargadas de calceína medido por ELS. (D) Imágenes SEM representativas de nanopartículas de PNA-Zr cargadas y sin marcar con calceína. Los enlazadores individuales utilizados para el ensamblaje de partículas se indican en la esquina superior izquierda de cada imagen (barras de escala = 2 \(\upmu\)m). (E) Evaluación de tamaños de partículas obtenidos mediante imágenes SEM (diámetro, nm). Para la determinación se evaluaron n = 30 partículas aleatorias. (F) Imágenes CLSM de células HeLa pLuc/705 tratadas con partículas de PNA-Zr cargadas con calceína (fluorescencia verde). Las células se incubaron durante 4 h con partículas cargadas de calceína (0,04 \(\upmu\)g/\(\upmu\)L) o calceína libre en la concentración correspondiente al contenido máximo de calceína de las partículas (0,0005 \(\upmu\) g/\(\upmu\)L). Posteriormente, las células se incubaron durante 4 h más con medio fresco antes de obtener imágenes. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul) y la actina se visualizó tiñendo con faloidina-rodamina (rojo).

Dado que los PNA se pueden utilizar como oligonucleótidos antisentido que modulan el proceso de empalme del ARNm celular, se evaluó la capacidad de las nanopartículas de coordinación PNA-Zr para transportar PNA funcionales de cambio de empalme al interior de las células. Kang et al. generaron células HeLa con expresión estable de un indicador de luciferasa (pLuc/705) para detectar correcciones del empalme aberrante de \(beta\)-globina causado por una mutación del intrón (IVS2-705)76,77. Aquí, generamos partículas de PNA-Zr que contienen la secuencia de PNA contra la ubicación de IVS2-705, que es capaz de inducir la corrección de empalme, si se administra en el núcleo de las células. Con este sistema de prueba, se puede detectar la actividad celular exitosa y el cambio de empalme mediante bioluminiscencia debido a la inducción de la expresión funcional de luciferasa77,78. Se ha utilizado un conector de PNA monocatenario con la secuencia PAMBA-CCTCTTACCTCAGTTACA-TPA (705 SSO) para la formación de partículas mediante el proceso de formación de dos pasos establecido.

La espectroscopía FT-IR confirmó la presencia del PNA 705 SSO relativamente largo en las partículas de PNA-Zr derivadas (Fig. S4 en el ESM). Al cuantificar la cantidad de PNA encapsulado después de la descomposición de las partículas de PNA-Zr, se determinó una eficiencia de encapsulación del 85,2%, en relación con la cantidad de PNA utilizada para la síntesis. Se trataron células HeLa pLuc/705 con nanopartículas de PNA-Zr y se evaluó la aparición de cambio de empalme mediante la determinación de la actividad luciferasa mediante mediciones de bioluminiscencia después de 48 h. En experimentos preliminares, las partículas desnudas de PNA-Zr no pudieron mediar en una corrección de empalme detectable. Dado que la captación celular de partículas de PNA-Zr se demostró previamente, se sospechaba que el responsable era el escape endosómico insuficiente, que generalmente representa un obstáculo crítico para la entrega de biomacromoléculas. Para mejorar el escape endosómico y permitir el transporte al objetivo intracelular, las partículas de PNA-Zr se recubrieron con un péptido artificial catiónico (Fig. 4A, B). Anteriormente se demostró que el lipopéptido (LP) LenA (Kε(N3)-Y3-Stp2-Kε[G-Kα,ε(ácido linolénico)2]-Stp2-Y3) es un agente adecuado para la administración de fosforodiamidato de cambio de empalme. oligómeros de morfolino (PMO) en células HeLa pLuc/705 después de la conjugación covalente78.

Dado que las partículas de PNA-Zr poseen un potencial zeta negativo, así como sitios metálicos coordinativamente insaturados en la superficie externa, se sugiere que el recubrimiento con la oligo (etanamino)amida LP LenA sea una estrategia factible para la modificación de nanopartículas postsintéticas. Las imágenes SEM determinaron la morfología de las partículas que se ensamblaron a partir de los conectores largos 705 SSO PNA (Fig. S5 en el ESM). Los resultados demostraron que 705 nanopartículas de SSO-Zr eran en su mayoría esféricas y presentaban tamaños pequeños de entre 150 y 250 nm de diámetro. Después del recubrimiento con LP LenA, se conservó la forma esférica, aunque pareció observarse un ligero aumento de tamaño. La modificación exitosa de la superficie de la nanopartícula 705 SSO-Zr con LP LenA se confirmó aún más mediante mediciones del potencial zeta, que determinaron un cambio distinto del potencial zeta negativo (\(-12\) mV) al positivo (+28 mV) después del recubrimiento ( Fig. S6 en el ESM). En el trabajo anterior, se descubrió que LP LenA mediaba en una liberación endosómica favorable de conjugados de PMO, presumiblemente debido a las interacciones de la membrana endosómica de los residuos de ácido linolénico insaturado contenidos. Para confirmar que los efectos beneficiosos de LP LenA en la administración celular también se pueden utilizar en combinación con partículas de PNA-Zr, se utilizaron células indicadoras HeLa mRuby3/gal8, que pueden visualizar los efectos sobre la integridad de la membrana endosómica. Las células informadoras expresan una proteína de fusión de galectina-8 y mRuby3. La galectina-8 es una proteína citosólica que se acumula en los endosomas dañados debido a la unión a restos de glicosilación ubicados en la superficie interna de las membranas endosómicas79,80. Las células HeLa mRuby3/gal8 se trataron con nanopartículas 705 SSO-Zr sin recubrir, partículas 705 SSO-Zr recubiertas con LP LenA o tampón HBG durante 8 h. Las imágenes CLSM después de 4 h adicionales de incubación con medio fresco mostraron que el tampón HBG y las partículas no recubiertas no condujeron a una redistribución de galectina-8 citosólica y no se detectó ninguna alteración de la integridad de la membrana endosómica (Fig. 4C). Por el contrario, las células HeLa mRuby3/gal8 tratadas con partículas recubiertas de LP LenA exhibieron una distribución puntuada de señales de mRuby3/gal8 con mayor intensidad de fluorescencia debido al daño de la membrana endosómica. En general, los resultados respaldan la hipótesis de que LP LenA puede facilitar el escape endosomal de PNA- Partículas de Zr.

Para determinar la actividad de cambio de empalme, se incubaron células HeLa pluc/705 con 705 partículas de SSO-Zr o el conector de PNA libre con y sin LP LenA durante 48 h, seguido de un ensayo de actividad de luciferasa. Para descartar cualquier actividad de luciferasa de fondo, los niveles de luminiscencia se normalizaron con respecto a las células de control tratadas con HBG y se determinaron como "aumento de la luminiscencia"77,78. Como se muestra en la Fig. 4d, una serie de diferentes proporciones entre PNA y LP LenA (1/0,5, 1/0,75, 1/1, 1/1,25, 1/1,5, 1/2, 1/2,5, 1/3) fueron usados.

Las células incubadas con PNA 705 SSO libre 5 \(\upmu\)M no mostraron una mayor actividad de luciferasa en ninguna proporción de mezcla de PNA a LP LenA. Por el contrario, la conjugación covalente de un derivado de PNA 705 SSO modificado con DBCO a LP LenA mediante química de clic sin cobre produjo una formulación con una distinta actividad de conmutación de empalme (Fig. S7 en el ESM). Es importante destacar que las partículas de 705 SSO-Zr recubiertas con LP LenA aumentaron claramente los niveles de luminiscencia en proporciones entre 1:0,5 y 1:3. El mayor aumento de luminiscencia (125 veces) se logró con una relación PNA/LP LenA de 1/1,25, que se determinó como condición óptima de recubrimiento. Las valoraciones de dosis con nanopartículas de PNA libre y PNA-Zr en la relación óptima PNA/LP LenA de 1/1,25 se llevaron a cabo en un rango de concentración de PNA entre 0,156 \(\upmu\)M y 5 \(\upmu\)M ( Figura 4e). De acuerdo con los resultados anteriores, el 705 SSO/LP LenA libre no indujo un aumento de la actividad de la luciferasa en ninguna concentración, mientras que las partículas de PNA-Zr aumentaron la luminiscencia entre 20 y 120 veces en concentraciones de PNA entre 0,625 y 5 \(\upmu\)M. . En comparación directa, las partículas de 705 SSO-Zr recubiertas con LP LenA indujeron niveles competitivos de actividad de luciferasa como la formulación covalente del conjugado LP LenA PNA [Fig. S7 en el MEDE]. Por el contrario, Lipofectamine 3000, que se incluyó como agente transfectante disponible comercialmente, no pudo aumentar la actividad de la luciferasa. Esta observación no es sorprendente, ya que los PNA representan análogos de ácidos nucleicos no cargados y se requeriría una modificación con restos lipófilos o cargados negativamente para la administración celular mediante lípidos catiónicos81,82,83. Para confirmar adicionalmente la ventaja de la formación de nanopartículas de PNA-Zr para la administración celular, se realizó otro experimento de control (Fig. S8 en el ESM). Se utilizó tampón fosfato (PBS) para competir con los enlazadores de PNA y desestabilizar las interacciones Zr-enlazador. Se desmontaron 705 nanopartículas de SSO-Zr con LP LenA en una proporción óptima de 1/1,25 mediante incubación con PBS. El tratamiento de células HeLa pLuc/705 con la solución obtenida mostró efectos insignificantes sobre los niveles de luminiscencia. Los resultados demuestran que las nanopartículas de PNA-Zr, inicialmente muy eficientes, perdieron su potencial de entrega tras la destrucción de las partículas. En resumen, los resultados demuestran que el PNA bioactivo puede conjugarse covalentemente con moléculas portadoras o, alternativamente, ensamblarse en nanopartículas para su administración celular.

Para evaluar la cinética del cambio de empalme y el inicio de la expresión de luciferasa, se investigó el impacto del tiempo de incubación con 705 partículas de SSO-Zr/LP LenA en la proporción de recubrimiento óptima (1/1,25). Se incubaron células HeLa pLuc/705 con dosis variadas de nanopartículas de PNA-Zr durante 12, 24, 36 y 48 h y se determinó la actividad luciferasa (Fig. S9 en el ESM). La razón del aparente retraso en la inducción de la luciferasa no es obvia, pero podría estar relacionada con la lenta liberación de PNA de los endosomas, la lenta liberación de PNA de las nanopartículas y el esencial tráfico intracelular hacia el núcleo.

Para confirmar que el aumento de la actividad de la luciferasa está realmente relacionado con los efectos específicos de secuencia del PNA antisentido de conmutación de empalme, se utilizaron como controles partículas compuestas de conectores de PNA con secuencias alternativas (PAMBA-GAGTATGAGA-TPA y PAMBA-GCAGCT-TPA) (Fig. S10 en el MEDE). Las células HeLa pLuc/705 se trataron con partículas de PNA-Zr de control con recubrimiento LP LenA en una proporción óptima de 1/1,25 durante 48 h. El ensayo de actividad de luciferasa posterior determinó que las partículas sin 705 SSO PNA no aumentaron la actividad de luciferasa, lo que confirma que el efecto observado de las partículas de 705 SSO depende de la secuencia.

El hecho de que las partículas puedan descomponerse mediante cantidades excesivas de iones fosfato planteó la cuestión de la estabilidad a diferentes concentraciones fisiológicas de fosfato (por ejemplo, de 1,12 mM a 1,45 mM en suero)84. Para abordar este aspecto, la estabilidad de las partículas se midió en diferentes diluciones de PBS que conducen a concentraciones variadas de fosfato, así como en suero bovino fetal (FBS) filtrado al 20% (0,2 \(\upmu\)m) (Fig. S11 en el ESM). Aquí, se observó una disminución de la estabilidad de las partículas dependiente de la concentración de fosfato, lo que podría conducir a una disminución de la estabilidad biológica pero también a una liberación intracelular favorable de PNA, ya que la concentración de fosfato es mayor dentro de las células. De manera similar, las partículas mostraron sensibilidad a la presencia de FBS y se disociaron en el transcurso de 1 h. En particular, el recubrimiento con LP LenA aumentó claramente la estabilidad sérica de las partículas, proporcionando así otra ventaja además de facilitar el escape endosomal.

El cambio de empalme previsto del intrón de globina \(\beta\) mutado en el modelo HeLa pLuc/705 se confirmó adicionalmente mediante RT-PCR (Fig. 4f, Fig. S12 en el ESM). El ARN total se extrajo de las células HeLa pLuc/705 48 h después del tratamiento con 705 SSO-Zr/LP LenA en una proporción óptima de 1/1,25. Posteriormente, la secuencia que rodea la \(\beta\)-globina IVS2 se amplificó mediante RT-PCR y se analizó mediante electroforesis en agarosa. La banda única (268 pb) obtenida de células de control tratadas con HBG representa el producto de empalme aberrante sin cambios. En el caso de 705 células tratadas con nanopartículas de SSO-Zr, se observó una aparición dependiente de la dosis de una banda adicional (142 pb) correspondiente al producto corregido por empalme. A diferencia de las mediciones de luciferasa, este ensayo es (semi)cuantitativo, lo que indica aproximadamente una corrección de empalme del 22 %, 9 % y 5 % a 5 \(\upmu\)M, 2,5 \(\upmu\)M y 1,25 \( \upmu\)M concentración de PNA, respectivamente (determinada mediante análisis de datos de imagen de intensidades de banda).

La citotoxicidad potencial de las partículas de PNA-Zr se investigó mediante el ensayo CellTiter-Glo\(^\circledR\) con células HeLa de tipo salvaje (Fig. S7(b), S13 en el ESM). De manera análoga a los experimentos de cambio de empalme, las células se incubaron durante 48 h con partículas de PNA o PNA-Zr libres en diferentes concentraciones y proporciones de LP LenA. Sin LP LenA, ni el PNA libre ni las partículas de PNA-Zr mediaron efectos sobre la actividad metabólica a 5 \(\upmu\)M, mientras que en combinación con el lipopéptido fue evidente una reducción de la actividad metabólica dependiente de la dosis y la proporción por encima de 1,25 \\ (\upmu\)M y pronunciado en 5 \(\upmu\)M (Fig. S10(b), S13 en el ESM). Concordantemente, se observó una menor actividad de luciferasa celular en células tratadas con partículas de PNA-Zr-LP LenA 5 \(\upmu\)M en comparación con 2,5 \(\upmu\)M (Fig. 4e), lo que es consistente con una actividad celular más baja. viabilidad. No es sorprendente que LP LenA, en analogía con otros agentes potentes de administración y lípidos catiónicos, afecte la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis, por ejemplo, alterando la integridad de la membrana lipídica85,86. Sin embargo, la combinación de partículas de PNA-Zr con recubrimiento LP LenA se considera una estrategia factible para aumentar la estabilidad de las partículas, facilitar la liberación endosómica y mejorar la entrega de PNA intracelular. De hecho, la optimización de los parámetros de las partículas, las proporciones de recubrimiento y la composición del agente de recubrimiento puede conducir a un equilibrio favorable entre la eficiencia de entrega y la tolerabilidad.

Entrega de PNA funcional mediante nanopartículas de coordinación PNA-Zr (A) Estructura de LP LenA compuesta por: azidolisina N-terminal, tirosina (Y), lisina (K), succinil-tetraetilenpentamina (Stp), glicina (G) y ácido linolénico. (B) Ilustración esquemática de nanopartículas de PNA-Zr recubiertas con LP-LenA y el proceso de administración intracelular. Creado con BioRender.com. (C) Imágenes CLSM de células HeLa mRuby3/gal8 tratadas con 705 partículas de SSO-Zr (izquierda), LP LenA recubiertas con 705 partículas de SSO-Zr (proporción 1/1,25, centro) y control HBG (derecha). Se incubaron células mRuby3/gal8 durante 8 h con partículas (contenido de PNA 2,5 \(\upmu\)M). Posteriormente, las células se incubaron durante 4 h más con medio fresco antes de obtener imágenes. (D) Actividad de conmutación de empalme de 705 nanopartículas de SSO-Zr (5 \(\upmu\)M PNA) en diferentes proporciones de recubrimiento de PNA/LP LenA en células HeLA pLuc/705. (E) Actividad de cambio de empalme de 705 nanopartículas de SSO-Zr (relación PNA/LP LenA de 1/1,25) a diferentes concentraciones de PNA en células HeLA pLuc/705. (F) RT-PCR de \(\beta\)-globina IVS2 de células HeLa pLuc/705 tratadas con PNA-Zr/LP LenA en una proporción de 1/1,25. El ARN total se aisló 48 h después de los tratamientos y se amplificó la \(\beta\)-globina IVS2. La banda a 268 pb representa el producto de empalme aberrante; La banda a 142 pb corresponde al producto después del cambio de empalme. La imagen se ha recortado para una presentación clara; el gel original se proporciona en la Fig. S12 del ESM.

Este trabajo informa sobre nuevas nanopartículas organometálicas, generadas mediante autoensamblaje impulsado por coordinación de conectores de ácido nucleico peptídico y nodos Zr (IV). Una variación sistemática de las arquitecturas de enlazadores de PNA identificó parámetros esenciales de diseño y síntesis: (1) los enlazadores de PNA monocatenarios y bicatenarios requieren dos funciones de ácido carboxílico aromático (PAMBA, TPA) para la interacción coordinativa con los nodos Zr(IV); (2) los conectores de PNA de doble cadena con ácidos carboxílicos aromáticos separados en ambas cadenas requieren al menos secuencias de 6 unidades; (3) la síntesis de nanopartículas requiere un procedimiento de dos pasos con preformación de nodos \(Zr_{6}O_{4}(OH)_{4}\), antes del ensamblaje con conectores PNA a temperatura ambiente; (4) las nanopartículas construidas a partir de conectores de PNA de doble cadena con ácidos carboxílicos aromáticos separados en ambas cadenas son sensibles a la degradación térmica, presumiblemente debido a la fusión del conector de PNA; y (5) las nanopartículas construidas a partir de conectores de PNA con ambos ácidos carboxílicos aromáticos en una sola hebra exhiben la mayor estabilidad. Las nanopartículas amorfas de PNA-Zr presentan una extraordinaria capacidad de carga de PNA de > 94 % p/p, son fácilmente absorbidas por las células y pueden entregar PNA antisentido funcionales después de recubrirlas con un lipopéptido catiónico para aumentar la estabilidad de las partículas y facilitar la liberación endosómica. Las nanopartículas de PNA-Zr son sensibles a interacciones competitivas y se degradan con el tiempo tras la exposición a iones de fosfato o suero; finalmente, se logró una modulación exitosa del empalme de ARNm mediante la administración de un PNA antisentido de cambio de empalme a través de nanopartículas de PNA-Zr recubiertas con lipopéptidos.

Sobre la base de los criterios de diseño identificados, se ha establecido una plataforma altamente flexible que combina la química del enlazador de PNA personalizable con el autoensamblaje coordinado para generar nanopartículas con actividad biológica impresa. Se sugiere que la plataforma de nanopartículas PNA-Zr presentada proporciona una alta flexibilidad para la generación de nanopartículas bioactivas y personalizables en secuencia con posible potencial para la formulación de fármacos en terapias de ARN.

Todos los reactivos se compraron a proveedores químicos comerciales. Los reactivos se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional a menos que se indique lo contrario. Los reactivos utilizados para los experimentos se resumen en la Tabla S1. Los tampones utilizados para los experimentos se resumen con su composición en la Tabla S2.

Se hinchó previamente una cantidad de 1 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (aproximadamente 1,6 mmol de cloruro) durante 30 minutos en 10 ml de diclorometano seco (DCM) en un reactor de jeringa (Multisyntech, Witten, Alemania). Luego se eliminó el DCM mediante filtración al vacío. La resina se agitó durante 60 min con una solución que contenía 3 ml de N,N-dimetilformamida (DMF), 4 ml de DCM seco, 0,6 mmol de ácido 4-(Fmoc-aminometil)benzoico (Fmoc-PAMBA-OH) y 1,8 mmol de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). Posteriormente, la solución se descartó mediante filtración al vacío y se añadió una solución de cierre que contenía 4 ml de DCM, 3 ml de metanol y 500 \(\upmu\)L de DIPEA. Después de agitar durante 30 min, se eliminó la solución y la resina se lavó tres veces con DMF y DCM. La resina se secó a alto vacío y se tomaron tres muestras para determinar la carga. Las muestras se agitaron con 1 ml de piperidina al 20 % en DMF a temperatura ambiente durante 1 h. Se diluyeron 50 \(\upmu\) L del sobrenadante de cada muestra con 1,95 ml de DMF y se midió la absorbancia a 301 nm con un espectrofotómetro Cary 3500 UV-Vis (Agilent Technologies, EE. UU.). Como solución blanco se utilizaron 50 \(\upmu\)L de piperidina al 20% en DMF diluida con 1,95 ml de DMF. La carga de resina se determinó con base en la siguiente fórmula:

Las síntesis de PNA se llevaron a cabo con un sintetizador de péptidos semiautomático Biotage Initiator+ SP Wave (Biotage, Uppsala, Suecia) a escalas de 30 \(\upmu\)mol en reactores de 10 ml. Para la síntesis de secuencias de PNA con PAMBA C-terminal, se cargó PAMBA con resina de cloruro de 2-clorotritilo; de lo contrario, se usó una resina H-Rink-Amide-Chemmatrix®. Inicialmente, la cantidad requerida de resina se hinchó previamente en 5 ml de DCM durante 30 minutos. Luego, la resina se desprotegió mediante cuatro incubaciones con 3 ml de piperidina al 20 % en N-metil-2-pirrolidona (NMP) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de cinco pasos de lavado con 4 ml de NMP. El acoplamiento de monómeros de PNA se llevó a cabo incubando 4 eq. de monómero de PNA, 4 eq. de Oxyma y 4 eq. de DIC con la resina durante 6 min a \(75\,^{\circ }\hbox {C}\) (irradiación con microondas). Cada paso de acoplamiento fue seguido por un triple lavado de resina con NMP y una reacción de acetilación para bloquear las aminas libres residuales. La acetilación se llevó a cabo mediante una incubación de 3 minutos a temperatura ambiente con 2,25 ml de una mezcla que contenía NMP/2,6-lutidina/anhídrido acético en una proporción de 89/6/5 (v/v/v). Los pasos de desprotección de Fmoc se llevaron a cabo mediante una incubación cuatro veces con 2,4 ml de piperidina al 20 % en NMP a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de un lavado de resina cinco veces con 2,5 ml de NMP. Después de cada paso de acoplamiento y desprotección, se realizó una prueba de Kaiser para determinar la presencia de aminas libres. Para esto, se transfirió una pequeña muestra de resina a un tubo de reacción de 1,5 ml y se añadió una gota de cada 80% de fenol en etanol (p/v), 5% de ninhidrina en etanol (p/v) y 20 \(\upmu\)M. Se añadió cianuro de potasio en piridina. La mezcla se incubó a \(99\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 4 min con agitación. La prueba de Kaiser indica la presencia de aminas libres mediante el cambio de la solución amarilla a un color azul intenso; de lo contrario, el color no cambia. Una vez completada la secuencia de PNA, se logró la modificación N-terminal con TPA con un procedimiento de acoplamiento ligeramente modificado. Se acopló TPA mediante incubación de la resina con una mezcla que contenía 4 eq. de tereftalato de mono-terc-butilo, 4 eq. 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 4 eq. Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidinofosfonio (PyBOP) y 8 eq. DIPEA se disolvió en DMF durante 10 min a \(70\,^{\circ }\hbox {C}\) (irradiación con microondas). Se introdujo ácido acético N-terminal mediante una etapa de acetilación como se describe anteriormente. Finalmente, la resina se lavó tres veces con DMF, tres veces con DCM. La resina se secó al vacío y se almacenó en un recipiente hermético a \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) hasta la escisión y el procesamiento de la construcción de PNA.

Los productos de PNA se escindieron de la resina previamente seca añadiendo un cóctel de escisión que contenía 2,85 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 75 \(\upmu\)L de triisopropilsilano (TIS) y 75 \(\upmu\)L de agua. La resina se agitó durante 90 min con un cóctel de escisión. La solución de escisión se añadió a 45 ml de una mezcla preenfriada de metil-terc-butil éter (MTBE) y n-hexano 1:1 (v/v) en un tubo de reacción de 50 ml, que se centrifugó durante 5 min a 4000 rpm (Megafuge 1.0 R, Heraeus, Hanau, Alemania). Se eliminó el sobrenadante y el sedimento de PNA se secó bajo un flujo de nitrógeno. El producto seco se disolvió en acetonitrilo al 30% en agua y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. La liofilización se realizó con un Christ Alpha 2–4 ​​LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Alemania). El producto se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna Sephadex G-10 conectada a un sistema purificador Äkta (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) y acetonitrilo al 30 % en agua como fase móvil. El rendimiento medio de la síntesis de PNA fue de alrededor del 60%.

Las muestras se detectaron en un AnchorChip MTP (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) cristalizando primero 1 \(\upmu\)L de solución matriz saturada de Super-DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico y ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzoico) , seguido de la adición de 1 \(\upmu\)L de solución de muestra. Después del secado, los espectros de masas se registraron en modo positivo con un espectrómetro de masas Autoflex II (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania).

La síntesis de partículas de PNA-Zr requirió un proceso de dos pasos para permitir el ensamblaje a temperatura ambiente y evitar la fusión de los dúplex de PNA. Un método previamente informado para la síntesis de UiO-66 a temperatura ambiente sirvió de base para la adaptación66. El primer paso fue la formación de nodos de Zr, que se logró mezclando 71 \(\upmu\)L de una solución de propóxido de circonio (IV) al 70% en peso en 1-propanol (0,0519 g, 0,158 mmol), 7 ml de DMF. y 4 ml de ácido acético en un recipiente de vidrio sellado. La solución se calentó a \(130\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 2 h. Luego, se observó un cambio notable de color de incoloro a amarillo. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de continuar con el segundo paso. Los conectores de PNA de doble cadena se sometieron a un proceso de hibridación, combinando las dos cadenas complementarias en una proporción equimolar (solo 1 cadena en el caso de secuencias palindrómicas) en una solución acuosa, calentando a \(90\,^{\circ }\hbox { C}\) durante 30 min y enfriar a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, se añadió acetonitrilo al 30%, las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se liofilizaron. Los conectores de PNA se disolvieron en DMF en concentraciones de 1 a 4 mg/ml, dependiendo de la solubilidad. Finalmente, la solución del nodo Zr preformada se mezcló con el conector PNA en una proporción equimolar. La mezcla se incubó durante 24 h a temperatura ambiente con agitación. Las partículas de PNA-Zr formadas se separaron de la solución mediante centrifugación durante 5 minutos a 4000 rpm y se lavaron tres veces mediante resuspensión repetida en DMF y centrifugación. Posteriormente, las partículas se lavaron dos veces con etanol, se resuspendieron en 1 ml de etanol y se almacenaron en \(4\,^{\circ }\hbox {C}\).

La eficiencia de encapsulación (EE) de PNA en nanopartículas de Zr se determinó cuantificando la cantidad molecular de PNA mediante absorción UV a 260 nm (164,3 ml/(\(\upmu\)mol \(\times\) cm) coeficiente de extinción para 705 SSO PNA. ). Después de la formación de nanopartículas de PNA-Zr, las partículas se descompusieron mediante competición con fosfato y la cantidad inicial de PNA liberado se normalizó a la cantidad de PNA utilizada para la síntesis de acuerdo con la siguiente fórmula:

Una cantidad de aprox. Se utilizaron 2 mg de partículas secas de PNA-Zr para la medición de XRD con un sistema de difractómetro de transmisión STOE Stadi MP con radiación Cu K\(\alpha\)1 (\(\lambda\) = 1,54060 Å) y un monocristal de Ge (111). monocromador. Los patrones de difracción se registraron con un detector de tira de estado sólido DECTRIS MYTHEN 1K (tamaño de paso de \(4,71\,^{\circ }\), tiempo de conteo de 120 s por paso). Los datos generados se analizaron con WinXPOW RawDat v3.0.2.5.

Aproximadamente 20 mg de partículas secas de PNA-Zr se desgasificaron a temperatura ambiente en alto vacío durante 38 h. La isoterma de sorción de nitrógeno se midió con una estación Autosorb iQ 1 en \(-195.8\,^{\circ }\hbox {C}\) y los datos generados se evaluaron utilizando el software ASiQwinTM (Versión 3.0, Quantachrome Instruments). El área de superficie de las muestras se calculó mediante la ecuación linealizada de Brunauer-Emmett-Teller (BET). Los tamaños de poro se calcularon de acuerdo con el modelo de carbono de la teoría funcional de densidad sólida apagada (a \(-195.8\,^{\circ }\hbox {C}\), nitrógeno y presión relativa entre 0 y 1 atm).

La espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) se realizó con tres muestras independientes. Las muestras se secaron primero al vacío durante 24 h seguido de un secado de 4 h a \(90\,^{\circ }\hbox {C}\). La digestión se realizó con 69% HNO3 en agua hasta su completa disolución. Luego las muestras se diluyeron con HNO3 al 3% en agua bidestilada y se midió el contenido de Zr mediante ICP-AES (CCD simultáneo ICP AES Vista RL de Agilent, longitudes de onda 257,2, 327,3, 339,2, 343,8 y 349,7, tiempo de succión 35 s, estabilización tiempo 45 s, potencia 1,25 kW). Se calculó el promedio de la relación Zr a masa total de tres muestras.

Las mediciones de tamaño y potencial zeta se realizaron con un Zetasizer Nano ZS con detección de retrodispersión (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) utilizando cubetas capilares plegadas DTS1070. Las partículas de PNA-Zr se sonicaron durante 5 minutos antes de las mediciones. Para las determinaciones de tamaño y PDI, se agregaron aproximadamente 2,5 \(\upmu\)g de partículas de PNA-Zr a 125 \(\upmu\)L de agua destilada. El índice de refracción se fijó en 1,330 y la viscosidad en 0,8872 cP. Las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con un tiempo de equilibrio de 1 min y al menos 6 subsecuencias. Posteriormente, se agregaron 835 \(\upmu\)L de NaCl 10 mM a las muestras para la determinación del potencial zeta mediante ELS. Las muestras se midieron tres veces a temperatura ambiente con un tiempo de equilibrio de 1 min y al menos 12 subensayos. Los potenciales Zeta se calcularon automáticamente basándose en la ecuación de Smoluchowski.

Se agitaron soluciones madre de partículas de PNA-Zr y se diluyeron 1:10 con etanol. Las soluciones diluidas se colocaron sobre la superficie hidrófoba de un soporte de muestra SEM. Las muestras secas se recubrieron con una capa de carbono mediante tres ciclos de deposición al vacío de carbono. Las mediciones SEM se llevaron a cabo con un SEM FEI Helios G3 UC de doble haz operado a 3 kV.

La estabilidad de las partículas de PNA-Zr en presencia de HBG y HEPES se investigó mediante medición fotométrica de la densidad óptica de las suspensiones de partículas. Para este propósito, se agregaron aproximadamente 50 \(\upmu\)L de soluciones madre de PNA-Zr en etanol a cubetas de cuarzo con 2 ml de HBG o HEPES. Se añadió el mismo volumen de etanol en cubetas separadas con HBG o HEPES como controles en blanco. La absorbancia de las muestras a 400 nm se controló en intervalos de 1 min durante 1 h. Los datos se recogieron con un espectrofotómetro UV-Vis Cary 3500 (Agilent Technologies, EE. UU.) en agitación constante. Para evaluaciones de estabilidad térmica, se agregaron partículas de PNA-Zr a 2 ml de agua. Se añadió el mismo volumen de etanol en cubetas separadas con agua como control en blanco. Se colocaron sondas de temperatura en las cubetas y las muestras se expusieron a un gradiente de temperatura entre \(25\,^{\circ }\hbox {C}\) y \(70\,^{\circ }\hbox {C} \) con un aumento de \(1\,^{\circ }\hbox {C}\) por min. La absorbancia de las muestras a 400 nm se midió después de cada \(0,5\,^{\circ }\hbox {C}\) aumento de temperatura. Los datos se recogieron con un espectrofotómetro UV-Vis Cary 3500 (Agilent Technologies, EE. UU.) en agitación constante. La estabilidad de las partículas en diferentes diluciones de PBS y en FBS al 20 % se investigó de manera similar mediante medición fotométrica de la densidad óptica de suspensiones de partículas. Se prepararon diferentes diluciones de PBS y se agregaron aproximadamente 50 \(\upmu\) L de suspensión de partículas de PNA-Zr en cubetas de cuarzo a 2 ml de solución. Se añadió el mismo volumen de etanol en cubetas separadas con dilución de PBS como control en blanco. Para la determinación de la estabilidad en presencia de suero, se preparó FBS al 20% en agua y se agregaron 50 \(\upmu\)L de suspensión de partículas de PNA-Zr a 2 ml de FBS al 20%. Como blanco se utilizaron 2 ml de FBS al 20% con 50 \(\upmu\)L de etanol. Los valores de absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 400 nm se determinaron cada minuto durante 1 h. La recolección de datos se realizó automáticamente con un espectrofotómetro UV-Vis Cary 3500 (Agilent Technologies, EE. UU.) en agitación continua.

Se cultivaron células HeLa pluc/705 y HeLa de tipo salvaje en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con bajo contenido de glucosa (1 g/l de glucosa). DMEM se complementó con 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 \(\upmu\)g/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron en matraces ventilados en la incubadora a \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada.

El lipopéptido artificial LP LenA, que se usaba anteriormente para la conjugación con PMO78 de cambio de empalme, se usó para recubrir nanopartículas de PNA-Zr. LP LenA se sintetizó mediante síntesis en fase sólida y tiene la secuencia Kε(N3)-Y3-Stp2-Kε[G-Kα,ε(ácido linolénico)2]-Stp2-Y3 (Y: tirosina; Stp: succinil-tetraetilenpentamina; K: lisina; G: glicina; Kε(N3): azidolisina). El contenido de 705 SSO PNA de las nanopartículas se determinó mediante el desmontaje de una pequeña muestra mediante competencia con PBS y cuantificación fotométrica del PNA liberado a 260 nm (164,3 ml/(\(\upmu\)mol \(\times\) cm) coeficiente de extinción. ). Según el contenido de PNA determinado, las nanopartículas se incubaron con cantidades estequiométricas de lipopéptido LP LenA durante 40 minutos antes de su posterior dilución en HBG.

Se disolvió PNA con la secuencia H-CCTCTTACCTCAGTTACA-NH\(_{2}\) (1 eq.) en 500 \(\upmu\)L de DMSO libre de agua con 10 equivalentes de DIPEA. Se añadió DBCO-NHS (5 eq.) en 250 \(\upmu\) L de DMSO libre de agua a la solución de PNA y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, la muestra se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando un sistema purificador Äkta (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia), una columna Sephadex G-10 y acetonitrilo al 30% en agua como fase móvil. Las fracciones del producto reunidas se liofilizaron y almacenaron a \(\hbox {-}20\,^{\circ }\hbox {C}\). Un día antes del experimento celular, se preparó una solución de PNA-DBCO 100 \(\upmu\)M en HBG suplementada con HCl 0,04 M y una solución de LenA LP 300 \(\upmu\)M en HBG. Se combinaron volúmenes iguales de ambas soluciones y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación a 300 rpm. Para experimentos con células, la formulación del conjugado de PNA se diluyó con HBG hasta las concentraciones deseadas.

El protocolo del fabricante para las transfecciones de ADN plasmídico (pDNA) con Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) se adaptó a los tratamientos con PNA. Se utilizó la cantidad requerida de Lipofectamine 3000 y P3000 para 200 ng de pDNA por pocillo. Con una cantidad fija de Lipofectamine 3000, se varió la cantidad de 705 SSO PNA para obtener soluciones de transfección de 50 \(\upmu\)M, 25 \(\upmu\)M, 12,5 \(\upmu\)M, 6,25 \(\ upmu\)M, 3,125 \(\upmu\)M y 1,5625 \(\upmu\)M. Se combinaron P3000 y la cantidad requerida de 705 SSO PNA en 25 \(\upmu\)L de DMEM sin suero. Se diluyó 1 \(\upmu\)L de Lipofectamine 3000 en 25 \(\upmu\)L de DMEM sin suero y se combinó con la solución que contenía P3000 y PNA. La solución mezclada se incubó a temperatura ambiente durante 15 min.

Se sembraron células HeLa pluc/705 en placas de 96 pocillos a una densidad de \(5\times 10^{3}\) células por pocillo 24 h antes de los tratamientos. El tratamiento celular se inició reemplazando el medio con 90 \(\upmu\)L de DMEM fresco que contenía suero y se agregaron 10 \(\upmu\)L de formulaciones de PNA a cada pocillo. Después de 48 h de incubación (o tiempos de incubación alternativos como se indica en los estudios cinéticos), se eliminó el medio y se agregaron 100 \(\upmu\) L de tampón de lisis (Promega, Mannheim, Alemania) a cada pocillo. Las células se incubaron con tampón de lisis durante 45 minutos a temperatura ambiente. La actividad luciferasa en 35 \(\upmu\)L de lisado celular se midió con una solución tampón luciferina-LAR (luciferina 1 mM, glicilglicina 20,94 mM, MgCl2 1 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 3,29 mM, ATP 0,55 mM, coenzima 0,28 mM). Una solución madre, pH 8,0-8,5) utilizando un luminómetro lector de placas Centro LB 960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Las unidades de luz relativas (RLU) se normalizaron para las células tratadas con HBG y los resultados se presentan como "aumento de veces en luminiscencia". Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

La viabilidad celular de las células HeLa de tipo salvaje se investigó mediante el ensayo CellTiter-Glo\(^\circledR\) después del tratamiento con partículas de PNA-Zr. Se sembraron células HeLa en placas de 96 pocillos a una densidad de \(5 \times 10^{3}\) células por pocillo 24 h antes de los tratamientos. Luego, el medio se reemplazó con 90 \(\upmu\)L de DMEM fresco que contenía suero y se agregaron 10 \(\upmu\)L de partículas de PNA-Zr a cada pocillo. Después de 48 h, se eliminó el medio y se agregaron 25 \(\upmu\)L de DMEM y 25 \(\upmu\)L de reactivo CellTiter-Glo\(^\circledR\) (Promega, Mannheim, Alemania). cada pozo. Las placas de pocillos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación y la bioluminiscencia se midió utilizando un luminómetro lector de placas Centro LB 960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Las actividades metabólicas relativas se calcularon mediante normalización con respecto a los pocillos de control tratados con HBG, según la siguiente fórmula:

Se sembraron células HeLa pluc/705 en placas de 24 pocillos a una densidad de \(5 \times 10^{4}\) células por pocillo 24 h antes de los tratamientos. Luego, el medio se reemplazó con 900 \(\upmu\)L de DMEM fresco que contenía suero y se agregaron a cada pocillo 100 \(\upmu\)L de suspensiones de partículas con concentraciones variadas. Las células se incubaron durante 48 h, luego se eliminó el medio y se realizó el aislamiento total del ARN con Tri-Reagent\(^\circledR\) (Sigma-Aldrich) según el protocolo del fabricante. Se utilizó un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo del fabricante para transcribir inversamente el ARN aislado en ADNc. Se realizó una PCR estándar con 300 ng de ADNc utilizando el kit de ADN polimerasa HotStarTaq Plus (QIAGEN) y los siguientes cebadores: 5\(^{\prime }\)-TTGATATGTGGATTTCGAGTCGTC-3\(^{\prime }\) (forward ) y 5\(^{\prime }\)-TGTCAATCAGGTGCTTTTGGCG-3\(^{\prime }\) (inverso). El programa de PCR estuvo compuesto por un ciclo inicial a \(95\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 5 min, seguido de 29 ciclos con \(95\,^{\circ }\hbox {C} \) durante 30 s, \(55\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 30 s, \(72\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 30 s y finalmente uno ciclo a \(72\,^{\circ }\hbox {C}\) durante 10 min. El producto de RT-PCR se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa (1,25 % de agarosa en tampón TBE que contiene GelRed\(^\circledR\)) a 90 V durante 45 min.

Se centrifugaron suspensiones de partículas de PNA-Zr en etanol y se eliminaron los sobrenadantes. Las partículas se resuspendieron en 1 ml de solución de calceína 0,25 mM en agua y se incubaron en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las partículas se centrifugaron y se lavaron tres veces con agua, tres veces con etanol y se almacenaron en etanol. Se desmontaron de 50 a 100 \(\upmu\)L de suspensiones de PNA-Zr marcadas con calceína mediante competencia con 1 ml de PBS. El contenido de PNA y calceína se cuantificó fotométricamente con un espectrofotómetro UV-Vis Cary 3500 a 260 nm (PNA) y 515 nm (calceína), respectivamente. Para partículas de PNA-Zr basadas en GCATGC-TPA se determinó una relación de PNA:calceína de 100:1,22 (p/p), basándose en PAMBA-GCAGCT-TPA una relación de 100:1,32 (p/p).

Para investigar la absorción celular de partículas cargadas con calceína, se sembraron células HeLa pLuc/705 en portaobjetos Ibidi \(\upmu\) de 8 pocillos (Ibidi GmbH, Planegg/Martinsried, Alemania) a una densidad de \(2 \times 10^). {4}\) células por pocillo 24 h antes de los tratamientos. Luego, el medio se reemplazó con 240 \(\upmu\)L de DMEM fresco que contenía suero y 60 \(\upmu\)L de partículas de PNA-Zr marcadas con calceína. Las células se incubaron durante 4 h con partículas, luego el medio se reemplazó con medio nuevo y la incubación continuó durante 4 h. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con 300 \(\upmu\)L/pocillo de paraformaldehído al 4% durante 45 minutos a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó dos veces con PBS y el portaobjetos se almacenó en PBS a \(4\,^{\circ }\hbox {C}\) durante la noche. La tinción celular se realizó mediante incubación con 300 \(\upmu\)L de PBS que contenía DAPI (2 \(\upmu\)g/mL) para la tinción de núcleos y faloidina-rodamina (1 \(\upmu\)g/mL). para la tinción del citoesqueleto de actina durante 30 minutos a temperatura ambiente en un ambiente protegido de la luz. La solución colorante se eliminó y se reemplazó con 300 \(\upmu\)L de PBS.

Para evaluar el efecto de las partículas recubiertas de LP LenA sobre la integridad de la membrana endosómica, se utilizaron células indicadoras HeLa mRuby3/gal8,87 que se basan en la construcción PB-CAG-mRuby3-Gal8-P2A-Zeo proporcionada por Jordan Green (plásmido Addgene n.º 150815 ; http://n2t.net/addgene:150815; RRID:Addgene_150815). Para la evaluación, se sembraron \(2\times 10^{4}\) células HeLa mRuby3/gal8 en 300 \(\upmu\)L de medio DMEM en portaobjetos Ibidi \(\mu\) de 8 pocillos. Las células se incubaron a \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) y 5% de CO2 durante 24 h. Luego se eliminó el medio y se añadieron 270 \(\upmu\)L de medio fresco y 30 \(\upmu\)L de LP LenA recubiertas (relación molar 1/1,25) o suspensiones de partículas de 705 SSO-Zr sin recubrir que contenían 25 \(\upmu\). Se añadieron )M de PNA a cada pocillo. Las células se incubaron durante 8 h con partículas, luego se retiraron las soluciones y se continuó la incubación con medio nuevo durante 4 h. Luego, las células se lavaron con PBS y cada pocillo se fijó con 300 \(\upmu\)L de paraformaldehído al 4% durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, los pocillos se lavaron nuevamente dos veces con PBS y se almacenaron en PBS a \(4\,^{\circ }\hbox {C}\). La tinción de los núcleos se realizó mediante incubación durante 30 minutos (a temperatura ambiente en un ambiente protegido de la luz) con 300 \(\upmu\)L de solución de PBS que contenía DAPI (2 \(\upmu\)g/mL). La solución colorante se eliminó y se reemplazó con 300 \(\upmu\)L de PBS. Las imágenes se tomaron con un microscopio de barrido láser confocal Leica-TCS-SP8 equipado con un objetivo HC PL APO 63x 1,4 (Alemania) y el software LAS X de Leica. La emisión de DAPI se registró a 460 nm, calceína a 530 nm, faloidina-rodamina a 580 nm y mRuby3 a 585 nm.

Los resultados se presentan como media aritmética ± desviación estándar. Los niveles de significancia se evaluaron mediante la prueba t de dos colas (no apareada). Los siguientes símbolos se utilizan para indicar niveles de significancia: *p \(\le\) 0,05, **p \(\le\) 0,01, ***p \(\le\) 0,001, ****p \( \le\) 0,0001 y 'ns' para no significativo.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Viena. EW agradece el apoyo del subproyecto B4 de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) SFB1032 (ID de proyecto 201269156). Ö.Ö. Agradezco las becas YLSY otorgadas por el Ministerio de Educación de Turquía como apoyo a su doctorado. Estudió en la Ludwig-Maximilians-Universität Munich. UL agradece el apoyo de la Fundación Galenus (Viena, Austria). Agradecemos a Teoman Benli-Hoppe, Simone Berger y Tobias Burghardt por realizar mediciones de espectrometría de masas MALDI-TOF, Surhan Göl Öztürk por su ayuda con los cultivos celulares, Steffen Schmidt por las mediciones SEM, Shizhe Wang por las mediciones XRD y Faqian Shen por las mediciones FT-IR. La figura TOC, el esquema 1 y los elementos gráficos de la figura 4 se crearon con Biorender.com.

Departamento de Farmacia y Centro de Nanociencia (CeNS), LMU Munich, 81377, Munich, Alemania

Özgür Öztürk, Anna-Lina Lessl, Miriam Höhn, Ernst Wagner y Ulrich Lächelt

Departamento de Ingeniería Genética y Bio, Universidad Alanya Alaaddin Keykubat, Antalya, Türkiye

Özgür Öztürk

Centro Vasco de Materiales (BCMaterials), Leioa, España

Stefan Wutke

Ikerbasque, Fundación Vasca para la Ciencia, Bilbao, España

Stefan Wutke

Departamento de Medicina Celular y Molecular, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Peter E. Nielsen

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Viena, Viena, Austria

Ulrico sonríe

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Ö.Ö.: Conceptualización, Metodología, Validación, Investigación, Redacción—borrador original. A.-LL: Metodología, Investigación. MH: Metodología, Investigación. SW: Conceptualización, Escritura—borrador original. PEN: Conceptualización, Escritura—borrador original. EW: Conceptualización, Supervisión, Adquisición de fondos, Redacción—borrador original. UL: Conceptualización, Supervisión, Adquisición de fondos, Redacción—borrador original.

Correspondencia a Ulrich Lächelt.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Öztürk, Ö., Lessl, AL., Höhn, M. et al. Nanopartículas de coordinación de ácido nucleico peptídico y circonio. Informe científico 13, 14222 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40916-w

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Recibido: 19 de diciembre de 2022

Aceptado: 18 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40916-w

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