Caracterización molecular de las rutas de electrones faltantes para la síntesis de butanol en Clostridium acetobutylicum.

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 4691 (2022) Citar este artículo

2654 Accesos

4 citas

Detalles de métricas

Clostridium acetobutylicum es un biocatalizador prometedor para la producción renovable de n-butanol. Ya se han desarrollado varias estrategias metabólicas para aumentar la producción de butanol, la mayoría de las veces basadas en la redirección de la ruta del carbono. Sin embargo, previamente se ha demostrado que las actividades tanto de la ferredoxina-NADP+ reductasa como de la ferredoxina-NAD+ reductasa, cuyos genes codificantes siguen siendo desconocidos, son necesarias para producir el NADPH y el NADH adicional necesarios para la síntesis de butanol en condiciones solventegénicas. Aquí, purificamos, identificamos y caracterizamos parcialmente las proteínas responsables de ambas actividades y demostramos la participación de las enzimas identificadas en la síntesis de butanol mediante un enfoque genético inverso. Además, demostramos que el rendimiento de la formación de butanol está limitado por el nivel de expresión de CA_C0764, el gen que codifica la ferredoxina-NADP+ reductasa y el operón bcd, que codifica una ferredoxina-NAD+ reductasa. La integración de estas enzimas en estrategias de ingeniería metabólica presenta oportunidades para desarrollar una cepa homobutanologénica de C. acetobutylicum.

Clostridium acetobutylicum es una bacteria anaeróbica grampositiva formadora de esporas capaz de convertir diversos azúcares y polisacáridos en ácidos orgánicos (acetato y butirato) y disolventes (acetona, butanol y etanol). Debido a su importancia en la producción industrial de los productos químicos a granel acetona y butanol1,2,3 y su uso potencial en la producción de n-butanol, un combustible líquido de base biológica prometedor con varias ventajas sobre el etanol4,5, muchas investigaciones se han centrado en ( i) comprender la regulación de la formación de disolventes6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y (ii) diseñar metabólicamente este microorganismo para producir altos rendimientos de alcoholes16,17,18.

Utilizando un enfoque de biología de sistemas global para la caracterización del metabolismo solventogénico de un cultivo quimiostato limitado en fosfato de C. acetobutylicum, se caracterizaron previamente los seis pasos involucrados en la conversión de acetil-CoA en butanol (Fig. 1): la enzima principal Se demostró que el responsable de la reducción de crotonil-CoA a butiril-CoA es el complejo BCD (codificado por bcd, etfB y etfA, el operón bcd), una enzima bifurcadora que consume dos moles de NADH y produce un mol de ferredoxina reducida, y la Se demostró que los dos últimos pasos de la producción de butanol estaban catalizados por AdhE1 a través de su actividad aldehído deshidrogenasa dependiente de NADH y por BdhB, BdhC y BdhA a través de su actividad butanol deshidrogenasa dependiente de NADPH. Estos resultados tuvieron un fuerte impacto en la distribución del flujo de electrones, ya que se demostró que tanto la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa como la de ferredoxina-NAD+ reductasa eran necesarias para producir el NADPH y el NADH adicional necesarios para la síntesis de butanol a partir de acetil-CoA (Fig. 2). 19. Aunque las actividades de estas enzimas se detectaron previamente en C. acetobutylicum6,20, los genes codificantes seguían siendo desconocidos19,21. Las enzimas ferredoxina-NADP+ reductasa (FNOR) (EC 1.18.1.3) se distribuyen en una variedad de organismos aeróbicos, desde procariotas hasta eucariotas, especialmente en plantas22, pero nunca se han purificado ni caracterizado a partir de ninguna especie de clostridios. Por el contrario, la reducción de NAD+ dependiente de ferredoxina acoplada a la exportación de protones (Rnf) y las transhidrogenasas dependientes de ferredoxina (Nfn) se han caracterizado desde una perspectiva molecular en varias especies de clostridios, pero no se han encontrado homólogos en C. acetobutylicum23,24,25. Además, se demostró que C. acetobutylicum era incapaz de producir NADPH mediante la vía oxidativa de las pentosas-fosfato, ya que faltaba un gen que codifica una glucosa-6-P deshidrogenasa, la primera y clave enzima de esta vía19,26.

El cuadro verde indica los productos primarios en condiciones acidogénicas, mientras que el cuadro rojo indica los productos primarios en condiciones solventegénicas. Las letras en rojo y cursiva indican los genes correspondientes. ack acetato quinasa, adc acetoacetato descarboxilasa, adhE1 aldehído deshidrogenasa, adhE2 aldehído/alcohol deshidrogenasa bifuncional, alsD alfa-acetolactato descarboxilasa, alsS acetolactato sintasa, bcd butiril-CoA deshidrogenasa, bdh butanol deshidrogenasa, buk butirato quinasa, crt crotonasa, ctfAB CoA-transferasa , etf electron transfer flavoprotein, hbd 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, hyd hydrogenase, fnor ferredoxin-NAD(P)+ oxidoreductases, pdc pyruvate decarboxylase, pfor pyruvate:ferredoxin oxidoreductase, pta phosphotransacetylase, ptb phosphotransbutyrylase, thl thiolase, gapC NADH-dependent gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa productora de NADPH no fosforilante gapN, Fd ox representa ferredoxina oxidada, mientras que Fd red representa ferredoxina reducida.

En condiciones acidogénicas (pH 6,3) (a) y solventegénicas (pH 4,4) (b). Todos los valores (mmol/gDCW/h) están normalizados al flujo de consumo de glucosa. Los datos se extrajeron de la ref. 19. La flecha negra representa el flujo total de oxidación de Fdred, la flecha roja el flujo de hidrogenasa, la flecha azul el flujo de Ferredoxina-NAD+ y la flecha verde el flujo de ferredoxina-NADP+.

En este trabajo, purificamos e identificamos las proteínas responsables de las actividades de ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ reductasa en C. acetobutylicum en condiciones solventegénicas. Confirmamos además su papel fisiológico esencial en la síntesis de butanol en C. acetobutylicum y demostramos que la producción de butanol está limitada por el flujo de electrones entre la ferredoxina reducida y tanto NADP+ como NAD+. Simplemente sobreexpresando el gen que codifica ferredoxina-NADP+, es posible producir butanol con un rendimiento que solo se había obtenido antes mediante un enfoque extenso de ingeniería metabólica18.

C. acetobutylicum puede, en teoría, convertir un mol de glucosa en un mol de n-butanol. La conversión de un mol de glucosa en dos moles de acetil-CoA está asociada con la producción de dos moles de NADH en la vía EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) y dos moles de ferredoxina reducida durante la descarboxilación de dos moles de piruvato a dos acetil-CoA usando piruvato ferredoxina oxidorreductasa (PFOR) (Fig. 1). Sin embargo, en condiciones solventegénicas, la conversión de dos moles de acetil-CoA en un mol de n-butanol produce un mol de ferredoxina reducida durante la reducción de crotonil-CoA a butiril-CoA por la butiril-CoA deshidrogenasa (BCD) y consume cuatro moles de NADH y un mol de NADPH para reducir el butiraldehído a n-butanol (Fig. 1) mediante las alcohol deshidrogenasas BdhB, BdhC y BdhA19 dependientes de NADPH.

Como la vía EMP produce menos NADH de lo que consume la vía n-butanol, por cada mol de n-butanol producido, se deben usar dos moles de ferredoxina reducida para producir dos moles de NADH usando una ferredoxina-NAD+ reductasa. Además, como C. acetobutylicum no tiene una vía oxidativa de pentosa-fosfato26 y como la gliceraldehído-3-P deshidrogenasa no fosforilante productora de NADPH codificada por gapN se expresa en un nivel bajo19, por cada mol de n-butanol producido, se requiere un mol de También se debe usar ferredoxina reducida para producir un mol de NADPH usando una ferredoxina-NADP+ reductasa.

A partir de este análisis, queda claro que las ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ reductasas son clave para proporcionar electrones para la producción de n-butanol (Fig. 2), pero hasta ahora, las proteínas involucradas permanecían totalmente desconocidas. Por lo tanto, decidimos purificar todas las enzimas con actividad ferredoxina-NAD+ o ferredoxina-NADP+ reductasa.

Las proteínas con actividades de ferredoxina-NADP+ reductasa se purificaron en condiciones anaeróbicas estrictas a partir del extracto crudo de C. acetobutylicum ATCC 824 como se describe en los métodos. Las proteínas se capturaron primero usando una matriz Capto-DEAE, y las fracciones eluidas activas se combinaron y luego se purificaron usando una columna Resource Q. Después de la concentración, las fracciones eluidas activas finalmente se cargaron en una columna Superose 12. Los resultados de una purificación tradicional se presentan en la Tabla 1. Las actividades se midieron a 340 nm mediante reducción de NADP+ utilizando ferredoxina reducida CA_C0303 como donante de electrones. Durante el proceso de purificación, la enzima purificada perdió el 60% de su actividad después de 48 h.

Las fracciones eluidas activas de la filtración en gel se sometieron luego a electroforesis en gel desnaturalizante. Como se muestra en la figura complementaria 1, el aumento de la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa parece estar relacionado con la concentración de una proteína con una masa molecular aparente de 45 kDa en SDS-PAGE.

La región del gel correspondiente a esta proteína se eluyó, se digirió con tripsina y se analizó mediante nano-LC-MS/MS como se describe en los métodos. El gen codificante es CA_C0764, anotado como una subunidad beta de glutamato sintasa dependiente de NADPH. Se aplicaron tratamientos idénticos a las proteínas de 40 y 55 kDa, que se identificaron como tiolasa (CA_C2873) y fosforribosilaminoimidazol carboxamida formiltransferasa-IMP ciclohidrolasa (CA_C1395). Ninguna de estas proteínas es oxidorreductasa. Los resultados de la identificación de genes se utilizaron para extraer los datos transcriptómicos y proteómicos cuantitativos realizados19, y se confirmó que la expresión de CA_C0764 de un operón monocistrónico fue mayor en condiciones solventegénicas que en condiciones acidogénicas (Fig. 3).

Región cromosómica CA_C0764 de C. acetobutylicum (a) con secuencias putativas -35 y -10 de CA_C0764 y CA_C0765 analizadas con la herramienta BPROM. b Análisis de la expresión de CA_C0764 bajo acidogénesis y solventogénesis. Cada barra de error indica la desviación estándar alrededor de la media de tres muestras biológicas de cultivos de quimiostatos. Los datos se extrajeron de los datos de los materiales complementarios de la ref. 19. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para validar la actividad ferredoxina-NADP+ reductasa de la proteína CAC0764, el gen CA_C0764 se clonó en un plásmido replicativo para fusionarlo con una pequeña etiqueta (Strep-tag II) colocada en la posición C-terminal de CAC0764, como se describe en el Método complementario. 1. La proteína recombinante se sobreexpresó homólogamente en MGCΔcac150227 (Método complementario 2) y luego se purificó a partir del extracto crudo en un solo paso usando cromatografía de afinidad en una columna Strep-Tactin. Las proteínas recombinantes se eluyeron con destiobiotina y la pureza de la fracción eluida se comprobó mediante SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie (Figura complementaria 2).

Como se esperaba, la electroforesis en gel desnaturalizante mostró una sola banda en la fracción eluida correspondiente a una masa molecular aparente de 45 kDa, lo que demuestra que CAC0764 era puro. Las actividades in vitro de ferredoxina-NAD(P)+ reductasa y NAD(P)H-ferredoxina reductasa se evaluaron en la fracción pura recuperada usando reducción de NADP+ con ferredoxina reducida como donante de electrones o reducción de metilviológeno mediante NADPH. Según la Fig. 4a, CAC0764-Strep-tag II purificado exhibió actividades tanto de NADPH-ferredoxina reductasa como de ferredoxina-NADP+ reductasa, y ninguna actividad se observó en presencia de NADH y NAD+. Estos resultados confirmaron que CAC0764 es una enzima FNOR que depende estrictamente de NADPH/NADP+. CAC0764 comparte homología de secuencia (~40 % de identidad) con una subunidad, NfnB, de la ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa (NfnAB) dependiente de NADH de Clostridium kluyveri. NfnAB es una enzima bifurcadora de electrones que cataliza la reducción endergónica de NADP+ con NADH acoplada a la reducción exergónica de NADP+ con ferredoxina reducida. Para investigar si CAC0764 podría catalizar la reacción de bifurcación de Nfn, se realizó un ensayo de reducción de NAD+ con CAC0764 purificado en presencia de sistemas generadores de NADPH y Fdox (consulte la sección de métodos), pero no se pudo detectar actividad, lo que demuestra que CAC0764 es una verdadera ferredoxina. -NADP+ oxidorreductasa.

a CAC0764-Strep-tag yb complejo Bcd-EtfB-Strep-tag-EtfA sobreexpresado y purificado a partir de células de C. acetobutylicum. Las actividades enzimáticas se determinaron utilizando viológeno de metilo oxidado (rojo) o ferredoxina reducida (azul) de acuerdo con la sección de Métodos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se encontraron homólogos de CAC0764 en todos los Clostridia productores de acetona-butanol-etanol (ABE). Para todos los clostridios pertenecientes al clado I27, C. acetobutylicum, C. roseum/C. aurantibutyricum/C. felsineum y C. pasturianum, los homólogos CAC0764 se expresaron como un operón monocistrónico, mientras que para los Clostridios del clado II, C. saccharobutylicum, C. beijerinckii, C. diolis DSM 15410, C. pasteurianum NRRL B-598 y C. saccharoperbutylacetonicum27 se expresaron como un operón bicistrónico con un gen homólogo a nfnA de C. kluyveri.

Las proteínas con actividades de ferredoxina-NAD+ reductasa se purificaron en condiciones anaeróbicas estrictas a partir del extracto crudo de C. acetobutylicum ATCC 824 como se describe en los métodos. Las proteínas se capturaron primero usando una matriz Capto-DEAE y se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0,1 a 0,25 M, produciendo dos picos (uno menor y otro mayor) de actividades de ferredoxina-NAD+ reductasa. Las fracciones eluidas con actividad máxima se combinaron por separado y luego se concentraron antes de cargarse finalmente en una columna Superose 12 o Resource Q. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Las fracciones eluidas activas de la filtración en gel y el Recurso Q se cargaron luego en electroforesis en gel desnaturalizante. Como se muestra en la figura complementaria 3, la actividad de la ferredoxina-NAD+ reductasa de la filtración en gel se asoció con la presencia de 3 proteínas de 41, 37 y 34 kDa, y la actividad de la ferredoxina-NAD+ reductasa del recurso Q se relacionó con la presencia de dos proteínas. de 167 y 53 kDa. Todas las proteínas se eluyeron, se digirieron con tripsina y se analizaron mediante nano-LC-MS/MS como se describe en Métodos. Los resultados indicaron que las tres proteínas eluidas de la filtración en gel eran las tres subunidades de la butiril-CoA deshidrogenasa codificada por bcd, etfB y etfA, y las dos proteínas eluidas del Resource Q eran las dos subunidades de la glutamato sintasa dependiente de NADH codificada por gltA y gltB. Anteriormente se demostró que el complejo enzimático BCD tiene actividad NADH-ferredoxina reductasa en presencia de crotonil-CoA19. Este estudio muestra claramente que BCD también tiene actividad ferredoxina-NAD+ reductasa en ausencia de crotonil-CoA o butiril-CoA.

Para determinar si se podía obtener actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa en ausencia de Bcd, se clonaron los genes etfB-etfA en un plásmido replicativo con una secuencia que codifica Strep-tag II colocada en la posición 3' de etfB con y sin bcd como el primer gen del operón sintético19. Las proteínas recombinantes se produjeron en E. coli a partir de los dos plásmidos y luego se purificaron en una columna Strep-Tactin. Cuando se expresaron los tres genes, se pudo purificar un complejo activo, mientras que cuando solo se expresaron dos genes, solo se pudo purificar EtfB, lo que indica que EtfB y EtfA no pueden formar un complejo en ausencia de Bcd.

Las actividades de ferredoxina-NAD+ reductasa, ferredoxina-NADP+ reductasa, NADH-ferredoxina y NADPH-ferredoxina reductasa del complejo Bcd-EtfB-EtfA se evaluaron en la fracción activa purificada recuperada de C. acetobutylicum. Según la Fig. 4b, el complejo purificado exhibió actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa, pero no se detectó actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, ni de NADH-ferredoxina ni de NADPH-ferredoxina reductasa. Estos resultados confirmaron que, además de su actividad butiril-CoA deshidrogenasa, el complejo Bcd-EtfB-EtfA puede exhibir actividad ferredoxina-NAD+ reductasa en ausencia de cualquier derivado de CoA.

Finalmente, se evaluaron las actividades de ferredoxina-NAD+ reductasa, ferredoxina-NADP+ reductasa, NADH-ferredoxina reductasa y NADPH-ferredoxina reductasa del complejo GltAB en la fracción activa purificada recuperada de C. acetobutylicum. Se detectaron actividades tanto de ferredoxina-NAD+ reductasa como de NADH-ferredoxina reductasa, mientras que se midió una actividad muy baja de ferredoxina-NADP+ reductasa o NADPH-ferredoxina reductasa, lo que indica que GltAB depende principalmente de NADH/NAD+ (Figura complementaria 4).

Para investigar el papel de las ferredoxina-NAD(P)+ reductasas en la producción de butanol in vivo, se utilizó la tecnología ClosTron basada en intrones del grupo II28 para inactivar los genes CA_C0764, gltB y etfB en MGCΔcac1502, un mutante útil para el análisis de genómica funcional29. Esta tecnología utiliza la inserción de un intrón del grupo II en un sitio genómico objetivo acoplado a un marcador activado por retrotransposición (resistencia a la eritromicina), lo que permite una inactivación estable del gen. Primero se dirigió a los intrones redirigidos para que se insertaran en la posición 407/408 de la cadena sensorial de CA_C0764 y en la posición 181/182 de la cadena sensorial de gltB (Método complementario 1). Después de la mutagénesis, los mutantes de inserción se verificaron combinando el cribado por PCR, la secuenciación y la hibridación Southern (Fig. 5) (Método complementario 3). Tanto MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT como MGCΔcac1502-gltb181s::CT se construyeron con éxito siguiendo el procedimiento descrito en el Método complementario 2.

a Representación esquemática del gen CA_C0764 con un intrón del grupo II insertado en la posición 408 en la cadena sentido de CA_C0764. b Detección por PCR para la identificación de supuestos mutantes CA_C0764-408s::CT utilizando cebadores específicos de genes que flanquean el sitio de inserción del intrón (carriles 2 a 5) (tamaño esperado 2060 pb) y control de PCR con ADN de tipo salvaje (carril 7) ( tamaño esperado 270 pb), carriles 1 y 8 escalera de ADN. c Hibridación Southern para demostrar la presencia de una única inserción de intrón en el mutante MGCΔcac1502cac0764-408s::CT seleccionado. La sonda intrón se marcó con DIG y se hibridó con ADN genómico digerido con HindIII-HF del mutante MGCΔcac1502cac0764-408s::CT (carril 2) con un tamaño esperado de 1970 pb. El ADN genómico digerido con HindIII-HF de la cepa MGCΔcac1502 de C. acetobutylicum (carril 1) también se analizó como control negativo. El carril 3 es una escalera de ADN de 1 kb. d Detección por PCR para la identificación de un supuesto mutante gltb181s::CT (entre tres colonias que se probaron) utilizando cebadores específicos de genes que flanquean el sitio de inserción del intrón (carriles 1 a 3) (tamaño esperado 2200 pb) y control por PCR con salvaje- escriba ADN (carril 4) (tamaño esperado 500 pb), carril 1 escalera de ADN. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se utilizó un enfoque similar utilizando el método ClosTron para inactivar el gen etfB. A pesar de los repetidos intentos y del uso de al menos dos plásmidos ClosTron redireccionados diferentes, no se pudieron obtener inserciones en el gen etfB. El bajo número de clones resistentes a eritromicina que surgieron aparentemente se había insertado en otras partes del genoma, lo que sugiere que la actividad ferredoxina-NAD+ reductasa de BCD es esencial para C. acetobutylicum.

Para comprender mejor el papel de la ferredoxina-NADP+ reductasa en el metabolismo central de C. acetobutylicum, se analiza el crecimiento y la formación de productos de una cepa con un gen cac0764 inactivado (MGCΔcac1502CA_C0764-408s::CT) y una cepa que sobreexpresa cac0764 (MGCΔcac1502 (pCLFCA_C0764) ) (Métodos complementarios 1 y 2) se compararon con la cepa de control MGCΔcac1502 y la cepa MGCΔcac1502 (pCons2-1) que contenía un plásmido de control vacío, respectivamente. Los rendimientos del producto final de todas las cepas después de 10 días de cultivo se muestran en las Fig. 6a, b.

a MGCΔcac1502 (pCons2-1) (azul), MGCΔcac1502 (pCLFCA_C0764) (rojo), MGCΔcac1502 (pCLFbcd-etfb-etfa) (marrón). b MGCΔcac1502 (azul), MGCΔcac1502-gltB181s::CT (rojo), MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT (marrón). Cada barra de error indica la desviación estándar alrededor de la media de cuatro cultivos independientes en frascos de suero a 37 °C en medio SM7. El asterisco indica que los resultados fueron significativamente diferentes del control según la prueba t de Student unilateral, con *valor de P ≤ 0,05, **valor de P ≤ 0,01 y ***valor de P ≤ 0,001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La Figura 6b muestra que la inactivación del gen que codifica la ferredoxina-NADP+ reductasa provocó una marcada disminución en el rendimiento de butanol (40% del rendimiento teórico) en comparación con la cepa MGCΔcac1502 parental (54% del rendimiento teórico). Por el contrario, el rendimiento de acetona + acetoína casi se duplicó (34% del rendimiento teórico en la cepa MGCΔcac1502 parental versus 50% del rendimiento teórico cuando se inactivó CA_C0764). Por otro lado, la sobreexpresión del gen que codifica la ferredoxina-NADP+ reductasa (Fig. 6a) favoreció la producción de butanol y aumentó significativamente el rendimiento de butanol (del 50% al 72% del rendimiento teórico) a expensas de la producción de acetona + acetoína. , cuyo rendimiento se redujo fuertemente del 33% al 11% del rendimiento teórico. Finalmente, la cepa con el gen que codifica la ferredoxina-NADP+ reductasa inactivado podría complementarse con la introducción del plásmido pCLF0764 que sobreexpresa CA_C0764, que restauró una alta producción de butanol (68% del rendimiento teórico) (Figura complementaria 5). Todos estos resultados fueron confirmados mediante mediciones de la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa (Fig. 7), que mostraron una actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa insignificante (<0,001 U/mg) cuando se inactivó CA_0764 y una alta actividad específica de ferredoxina-NADP+ reductasa cuando CA_0764 se sobreexpresó de el plásmido pCLF0764 (1,54 U/mg +/- 0,07, frente a 0,0326 U/mg +/- 0,007 para el control).

Se usó MGCΔcac1502 (azul) como cepa de control y se comparó con los mutantes MGCΔ1502-CA_C0764-408s::CT (verde) y MGCΔcac1502(pCLFCA_0764) (rojo). Los gráficos de barras son promedios de dos duplicados biológicos. Para los ensayos enzimáticos, consulte "Métodos". Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Estos resultados demostraron claramente la participación de la enzima ferredoxina-NADP+ reductasa en la vía de producción de butanol de C. acetobutylicum en condiciones solventegénicas. Además, también se demostró que el rendimiento de n-butanol estaba limitado por el nivel de actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa.

Para comprender mejor el papel de las ferredoxina-NAD+ reductasas en el metabolismo central de C. acetobutylicum, se utilizó una cepa con un gen gltB inactivado (MGCΔcac1502-gltB181s:CT) y una cepa que sobreexpresa los genes que codifican el complejo Bcd-EtfB-EtfA (MGCΔcac1502 ( pCLF bcd-etfb-etfa)) (Métodos complementarios 1 y 2) se cultivaron anaeróbicamente en matraces líquidos que contenían SM con 60 g/l de glucosa en las mismas condiciones, y se midieron el crecimiento y la formación de producto. El análisis fenotípico comparativo se realizó midiendo tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación (Fig. 6). La inactivación de gltB no tuvo ningún efecto sobre el perfil del producto, lo que sugiere que el complejo enzimático GltAB desempeña un papel menor en la producción de NADH a partir de ferredoxina reducida. Por el contrario, la sobreexpresión del operón bcd-etfB-etfA aumentó el rendimiento de butanol (del 50 al 56% del rendimiento teórico) a expensas de la producción de acetona y acetoína, que se redujo del 33 al 28% del rendimiento teórico. Esto, más el hecho de que un mutante etfB knockout no es viable, sugiere fuertemente que el complejo BCD es responsable de la actividad ferredoxina-NAD+ reductasa en C. acetobutylicum.

En este estudio, demostramos que en condiciones solventegénicas, CAC0764 es la única enzima responsable de la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa en C. acetobutylicum. Como se demostró previamente que la vía oxidativa de las pentosas-fosfato falta en C. acetobutylicum21,26, abordamos la siguiente pregunta: ¿cómo puede el mutante MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT generar el NADPH necesario para la producción residual de butanol y las reacciones anabólicas? ? Otra enzima productora de NADPH ya identificada en C. acetobutylicum es la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GapN), codificada por CA_C3637, una enzima no fosforilante que cataliza la oxidación del gliceraldehído-3-fosfato a 3-fosfoglicerato (Fig. 1). En cultivos quimiostáticos solventegénicos, se demostró que esta enzima cataliza menos del 5% del flujo total de la vía EMP19. Para determinar si gapN podría regularse positivamente en el mutante MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT en comparación con la cepa de control MGCΔ1502, se llevó a cabo un análisis cuantitativo por PCR con transcriptasa inversa (RT-qPCR) en ambas cepas para determinar la expresión relativa de genes gapN y gapC (que codifican los genes GAPDH dependientes de NADH) utilizando el gen fabZ como gen de referencia de normalización30. Los experimentos se realizaron como se describe en el Método complementario 4, y la expresión normalizada de gapN y gapC en las cepas MGCΔcac1502 y MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT se presenta en la Fig. 8.

Se usó MGCΔcac1502 (azul) como cepa de control y se comparó con el mutante MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT (rojo). Los gráficos de barras son promedios de dos duplicados biológicos. La expresión de gapC y gapN se midió utilizando RTq-PCR y el gen fabZ (CA_C3571) como estándar interno según el Método complementario 4. Para cada muestra biológica, se representa el promedio de los triplicados técnicos (círculo negro). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Según la Fig. 8, el nivel de expresión relativo de gapN en el mutante MGCΔ1502-CA_C0764-408s::CT fue 4,3 veces mayor que el nivel de expresión relativo de gapN en MGCΔcac1502, lo que muestra que este gen estaba regulado positivamente en la cepa mutante.

Con base en el análisis fenotípico realizado en condiciones solventegénicas, la determinación de la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa en el extracto crudo celular y los resultados de la expresión de GapN, se realizó un análisis redox para determinar cómo se utiliza la ferredoxina reducida para lograr el equilibrio redox en cada cepa ( Tabla complementaria 3).

Cuando se inactiva CAC0764, la ferredoxina reducida se usa principalmente para la producción de hidrógeno mediante la HydA hidrogenasa, una cantidad menor se usa para la producción de NADH (necesaria para la síntesis de etanol, butirato, lactato y butanol) y el 28 % del flujo de EMP es catalizado por GapN. para producir el NADPH necesario para la síntesis y el anabolismo del n-butanol. Por el contrario, cuando se sobreexpresa CAC0764, la ferredoxina reducida se utiliza principalmente para la formación de NADH y NADPH necesarios para la producción de etanol, butirato y butanol y las reacciones anabólicas.

Las actividades de ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ reductasa se midieron en C. acetobutylicum hace más de 40 años20. Otros grupos estudiaron más a fondo sus actividades en diferentes condiciones fisiológicas, pero las proteínas nunca fueron purificadas ni caracterizadas2,6. Su papel clave en la producción de butanol también se sugirió hace mucho tiempo a partir de un modelo estequiométrico del metabolismo31, pero nunca se demostró mediante un enfoque genético inverso. Más recientemente, utilizando un modelo actualizado a escala genómica limitado por datos transcriptómicos y proteómicos19, el estudio cuantificó y demostró la necesidad de que las reductasas ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ produzcan butanol en condiciones solventegénicas. Como todos los esfuerzos para identificar estas proteínas mediante búsquedas explosivas no tuvieron éxito, se desarrolló un protocolo de purificación clásico para aislar las reductasas ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ de C. acetobutylicum. La estrategia aplicada permitió la identificación de solo una proteína que cataliza la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa (codificada por el gen CA_C0764) y dos complejos enzimáticos (Bcd-EtfB-EtfA y GltAB) que tienen actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa.

La ferredoxina-NADP+ reductasa de C. acetobutylicum no comparte ninguna identidad de aminoácidos con las ferredoxina-NADP+ reductasas descritas previamente de otras bacterias y comparte un 30% de identidad con GltB (la cadena β de la glutamato sintasa dependiente de NADH) (Figura complementaria 6). , explicando su anotación incorrecta. Sin embargo, se expresa como un operón monocistrónico, que no encaja con una organización genética como un operón bicistrónico de genes que codifican la glutamato sintasa. Se demostró que CAC0764 es estrictamente dependiente de NADPH/NADP+, y se requiere FAD para conservar la actividad enzimática completa, como se describe generalmente para la familia de enzimas ferredoxina-NADP+ reductasa22. Se encontraron homólogos de CAC0764 en todos los Clostridia productores de ABE (acetona-butanol etanol). Para todos los clostridios pertenecientes al clado I27, C. acetobutylicum, C. roseum/C. aurantibutyricum/C. felsineum y C. pasturianum, los homólogos de CAC0764 se expresaron como un operón monocistrónico, mientras que para los Clostridios del clado II, C. saccharobutylicum, C. beijerinckii, C. diolis DSM 15410, C. pasteurianum NRRL B-598 y C. saccharoperbutylacetonicum27 se expresaron como un operón bicistrónico con un gen homólogo a nfnA de C. kluyveri. Entonces podemos concluir que para todos los Clostridia solventegénicos del clado I, el NADPH es producido por una ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa, mientras que para todos los Clostridia del clado II, el NADPH es producido por una ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa dependiente de NADH.

Anteriormente se demostró que los dos complejos enzimáticos con actividad NADH-ferredoxina reductasa BCD y GltAB eran una butiril-CoA deshidrogenasa19 y una glutamato sintasa dependiente de NADH19, respectivamente. Como la inactivación de gltB no tuvo ningún efecto sobre el perfil del producto, el complejo enzimático GltAB probablemente desempeña un papel menor in vivo en la transferencia de electrones de la ferredoxina reducida a NAD+. Por el contrario, el hecho de que (i) la sobreexpresión del operón bcd-etfB-etfA incrementó el rendimiento de butanol y (ii) un mutante etfB knockout no sea viable, sugiere fuertemente que el complejo BCD es responsable de la actividad ferredoxina-NAD+ reductasa en C. acetobutylicum. BCD es una enzima bifurcadora que reduce crotonil-CoA a butiril-CoA con el consumo de dos NADH y la producción de una ferredoxina reducida. Esto permite la transferencia endergónica de electrones del NADH para oxidar la ferredoxina y eliminar el exceso de NADH asociado con la producción de acetato en condiciones acidogénicas6,19. Lo que se demuestra aquí es que en ausencia de crotonil-CoA o butiril-CoA, esta enzima también puede realizar transferencias de electrones exergónicos desde la ferredoxina reducida a NAD+.

Desde una perspectiva fisiológica, la inactivación del gen que codifica la ferredoxina-NADP+ disminuyó significativamente la producción de butanol y aumentó la producción de acetona, mientras que su sobreexpresión tuvo el efecto contrario, con un rendimiento muy alto de n-butanol a partir de glucosa del 72% del valor teórico (Suplementario). Figura 7). Esto sugiere que la producción de butanol, en condiciones solventegénicas, está potencialmente limitada por el flujo de producción de NADPH y demuestra que los flujos de carbono también pueden modularse manipulando los flujos de electrones. Además, en ausencia de ferredoxina-NADP+ reductasa, C. acetobutylicum mantiene un cierto flujo de producción de NADPH al expresar un nivel más alto de gapN, un gen que codifica la gliceraldehído-3-P deshidrogenasa dependiente de NADP+ no fosforilada. En este mutante, hasta el 28% del flujo de EMP es catalizado por GapN, lo que da como resultado una menor producción de ATP.

Los intentos de eliminar etfB para suprimir la actividad de la ferredoxina-NAD+ reductasa no han tenido éxito. Esto sugiere que C. acetobutylicum no puede crecer en ausencia de actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa. Consistentemente, todos los análisis de flujo de electrones realizados en cultivos quimiostáticos de C. acetobutylicum en condiciones acidogénicas, solventegénicas o alcohológenas19 muestran un alto flujo en la reacción catalizada por la ferredoxina-NAD+ reductasa. Además, podemos demostrar utilizando el modelo a escala del genoma iCac967 que un mutante etfB que no podría producir butirato y butanol y que no tendría actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa podría sobrevivir solo si produjera lactato como único producto de fermentación. Una redirección tan drástica de los flujos metabólicos probablemente no sea posible mediante la regulación de la vía metabólica y podría explicar por qué el mutante etfB no es viable.

El descubrimiento de los genes que codifican la ferredoxina-NADP+ y la ferredoxina-NAD+ reductasa y la demostración de su papel clave en la producción de butanol presentan la posibilidad de estrategias de ingeniería metabólica complementarias para crear una cepa homobutanologénica de C. acetobutylicum.

Todas las cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este estudio o derivados de él se enumeran en las Tablas complementarias 1 y 2. Los procedimientos para la construcción de plásmidos se detallan en el Método complementario 1.

Las cepas de E. coli se cultivaron aeróbicamente a 37 °C en medio Luria-Bertani (LB) suplementado, cuando fue necesario, con ampicilina (100 µg/mL) y/o cloranfenicol (30 µg/mL). Se añadió agar (15 g/l) antes de la esterilización en placas de agar LB.

Las cepas MGCΔcac1502, MGCΔcac1502-CA_C0764-408s::CT y MGCΔcac1502 gltB181s::CT se mantuvieron en forma de esporas a -20 °C en medio sintético (SM). Las cepas MGCΔ1502-CA_C0764-408s::CT pCLFCA_C0764, MGCΔ1502 pCLFCA_C0764, MGCΔ1502 pCLF bcd-etfb-etfa y MGCΔ1502 pCons2-1 se mantuvieron en placas SM de glucosa con tiamfenicol (10 μg/mL) y se usaron directamente para inocular líquido. cultivos en matraz que contienen glucosa SM con tiamfenicol (50 μg/mL). Los cultivos en matraz líquido de todas las cepas de C. acetobutylicum se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C en 30 ml de SM7 con 55 g/l de glucosa. Los cultivos líquidos de las cepas recombinantes se realizaron al menos por cuadruplicado.

La concentración celular se midió turbidimétricamente monitoreando la densidad óptica (OD) a 620 nm; Para los cálculos de concentración de biomasa se utilizó un factor de correlación derivado experimentalmente de 0,3 g de peso seco celular por DO620 nm. Las concentraciones de glucosa, piruvato, lactato, acetato, butirato, acetoína, glicerol, etanol, acetona y butanol se midieron en los sobrenadantes del cultivo mediante análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (serie Agilent 1200, Massy, Francia)17. En todas las figuras, los rendimientos se expresaron en moles de cada producto por mol de glucosa consumida. Para fines de comparación de cepas, el rendimiento de butanol y acetona también se expresó en % del rendimiento teórico con un rendimiento teórico de formación de butanol o acetona de un mol de n-butanol o acetona por mol de glucosa consumida.

Los ensayos de actividad de ferredoxina-NAD(P)+ reductasa y de actividad de NAD(P)H-ferredoxina reductasa se realizaron en una estación de trabajo anaeróbica bajo una atmósfera de nitrógeno. Todas las soluciones de reactivos se prepararon en tampón de ensayo (previamente hervido y desgasificado con nitrógeno) y se mantuvieron bajo una atmósfera de nitrógeno. Las actividades específicas se determinaron en un rango donde se estableció la linealidad con la concentración de proteínas. Cada ensayo enzimático se realizó al menos por duplicado. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µM de sustrato por minuto. Las concentraciones de los componentes en las mezclas de reacción (1 ml de volumen total) se dan a continuación.

La actividad in vitro de la ferredoxina-NAD(P)+ reductasa se analizó midiendo la reducción de NAD+ o NADP+ utilizando electrones de ferredoxina reducida (CA_C0303) con H2 como reductor de ferredoxina (CA_C0303)32 en presencia de Fe-Fe hidrogenasa de Clostridium. acetobutylicum (CA_C0028)33. La ferredoxina (CA_C0303) se produjo a partir de un cultivo anaeróbico de la cepa recombinante de E. coli ΔiscRpthl-Fd-LL-C-Tag y se purificó en forma de ferredoxina fusionada con Strep-tag II utilizando una columna HP Strep-Trap preenvasada (Cityva, Suecia) y un tampón de elución que contiene destiobiotina 7,5 mM33. La reacción se realizó anaeróbicamente a 37 °C en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7) con DTT 2 mM, FAD 25 µM, ferredoxina 13 µM o viológeno de metilo 150 µM, NAD+ o NADP+ 1,6 mM, 6 U (o más) de hidrogenasa HydA purificada de C. acetobutylicum y extracto crudo (o proteína purificada), seguido de un seguimiento del aumento de A340 nm como indicación de la aparición de NADH o NADPH usando un espectrofotómetro (Hewlett Packard 8453). Después de una corriente suave con hidrógeno en las cubetas de cuarzo, los ensayos se iniciaron mediante la adición de ferredoxina y luego, después de la reducción de la ferredoxina (~5 min), mediante la adición de NAD+ o NADP+. En todas las reacciones, las velocidades no enzimáticas se restaron de las velocidades de reacción iniciales observadas.

La actividad in vitro de NAD(P)H-ferredoxina reductasa se analizó monitorizando el aumento en A560 nm como indicación de la reducción de metil viológeno usando un espectrofotómetro (Hewlett Packard 8453). La reacción se llevó a cabo anaeróbicamente a 37 °C en cubetas de cuarzo en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,6) con DTT 2 mM, FAD 10 µM, NADPH 250 µM o NADH, etanol 3 % vol/vol. 45 U Adh (S. cerevisiae), metil viológeno 10 mM y extracto crudo o proteína purificada. Los ensayos se iniciaron mediante la adición de metil viológeno. En todas las reacciones, las velocidades no enzimáticas se restaron de las velocidades de reacción iniciales observadas.

La actividad in vitro de la ferredoxina-NAD+ oxidorreductasa dependiente de NADPH se analizó34 monitorizando el aumento de A380 nm como indicación de la reducción de NAD+ utilizando un espectrofotómetro (Hewlett Packard 8453). La reacción se llevó a cabo anaeróbicamente a 37 °C en cubetas de cuarzo en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,6) con NADP+ 0,5 mM, glucosa-6-fosfato 40 mM y 2 U de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. (sistema de regeneración NADPH), NAD+ 10 mM, ferredoxina 10 μM y 1 U de HydA hidrogenasa purificada. Para la fase gaseosa se utilizó N2. La reacción se inició con la adición de CAC0764. (ε = 1,2 mM-1 cm-1). La formación de un μmol de NADH por minuto se definió como una unidad.

Los coeficientes de extinción del metilviológeno a 560 nm, del NADH a 380 nm y del NADH y NADPH a 340 nm fueron 7,71 mM-1 cm-1, 1,2 mM-1 cm-1, 6,22 mM-1 cm-1 y 6,29 mM-1 cm-1, respectivamente. La concentración de proteína total del extracto libre de células o fracción purificada se determinó mediante el método de Bradford (reactivo Bio-Rad)35 con albúmina sérica bovina como estándar.

La cepa C. acetobutylicum ATCC 824 se mantuvo en forma de esporas a -20 °C en SM. Los cultivos en matraz de cepas de C. acetobutylicum se cultivaron anaeróbicamente en SM, se inocularon con una solución madre de esporas al 10 % (v/v) y se sometieron a un choque térmico a 80 °C durante 15 min. Las células se cultivaron a 37 °C hasta una DO620 nm de ~2,0 y el pH se mantuvo tamponando el medio de cultivo con carbonato de calcio antes de la inoculación del biorreactor al 10 % (v/v). Se realizaron fermentaciones discontinuas con pH controlado en SM. Se utilizó un biorreactor Biostat B de 2 L (Sartorius, Aubagne, Francia) con un volumen de trabajo de 1,3 L36. Después de la esterilización, el medio se roció con nitrógeno libre de O2 durante 30 minutos. Durante el transcurso del experimento, el medio se mantuvo bajo una ligera sobrepresión de nitrógeno para evitar la entrada de O2 al reactor. Todos los tubos estaban hechos de caucho butílico y la salida de gas del reactor estaba protegida con un dispositivo de pirogalol. Los cultivos se agitaron a 300 rpm, la temperatura se fijó en 35 °C y el pH se mantuvo en 4,8 con la adición automática de NH4OH (3 N). La concentración celular se midió turbidimétricamente monitoreando la densidad óptica (DO) a 620 nm (Biochrom libra S11), y la formación de producto se midió por duplicado mediante análisis HPLC (Agilent 1200 series, Massy, Francia)17. Cuando la DO620 nm alcanzó ~16, después del cambio de la fase acidogénica a la fase solventegénica, las células se recogieron bajo presión de hidrógeno y se transfirieron a una cámara anaeróbica. Las células se lavaron y concentraron 20 veces en tampón Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7,6) y se congelaron a -80 °C.

Todos los procedimientos de purificación se realizaron en condiciones anaeróbicas. Todos los tampones de purificación se desgasificaron previamente y se añadieron FAD 10 µM y DTT 2 mM para evitar pérdidas de actividad irreversibles.

Las células congeladas de cultivos discontinuos solventogénicos de C. acetobutylicum ATCC 824 se descongelaron y se rompieron mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4 ° C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Los residuos se eliminaron mediante centrifugación a 8600 xg durante 10 minutos a 4 ° C (centrífuga Sigma 2–16 K). Los ácidos nucleicos se precipitaron mediante la adición de sulfato de estreptomicina (200 µg/ml) al sobrenadante y se eliminaron mediante centrifugación como se describió anteriormente. Luego, el extracto recuperado se diluyó cinco veces en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8) antes de cargarlo en una matriz HiTrap Capto-DEAE de 5 ml (Cytiva, ref. 28-9165-40) conectada a un purificador AKTA (Cytiva, Suecia). ). Las fracciones activas se examinaron con el ensayo de ferredoxina-NAD+ y ferredoxina-NADP+ reductasa utilizando ferredoxina reducida como donante de electrones. La columna se equilibró en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8) y la elución se realizó con un gradiente de 3 pasos de tampón Tris-HCl 100 mM + tampón NaCl 1 M (pH 8): 1 CV 0–4%, 20 CV 4–16 % (elución objetivo) y 5 CV 16–100 %; Se recogieron fracciones de 2 ml. Para la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, las fracciones más activas de la columna Capto-DEAE se combinaron antes de cargarlas en una columna Resource Q equilibrada en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8) para un segundo paso cromatográfico. Luego se recogieron las fracciones eluidas más activas y se concentraron en un Vivaspin 15/10.000 MW (Sartorius Stedim, ref. VS1502) para reducir el volumen de la muestra a 150 µl mediante centrifugación a 3000 xg durante 15 min. Para el último paso de purificación, se cargó un volumen de muestra de 150 μL en una columna Superose 12, 10/300 GL (GE Healthcare, ref. 17-5173-01) previamente equilibrada en tampón Tris-HCl 100 mM + NaCl 150 mM (pH 7.6), y se recogieron fracciones de 400 µL. Para la actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa, las fracciones activas de la columna Capto-DEAE de cada pico eluido se agruparon antes de cargarse en un Resource Q equilibrado en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8) para un segundo paso cromatográfico o en un Superose. 12 columnas 10/300 GL (GE Healthcare, ref. 17-5173-01) previamente equilibradas en tampón Tris-HCl 100 mM + NaCl 150 mM (pH 7,6), y se recogieron fracciones de 400 µL. Finalmente, la concentración de proteínas totales del extracto libre de células o fracciones purificadas se determinó mediante el método de Bradford (reactivo Bio-Rad)35 con albúmina sérica bovina como estándar.

Se calcularon los rendimientos y el factor de purificación de cada paso. El factor de pureza de las fracciones activas separadas también se evaluó mediante electroforesis en SDS en geles de poliacrilamida de 40 ml.

Las fracciones eluidas activas recogidas después de la cromatografía Superose 12 o Resource Q se cargaron en electroforesis en gel desnaturalizante y las proteínas se tiñeron con plata. Para la fracción activa de ferredoxina-NADP+ reductasa se utilizó la región del gel correspondiente a la proteína de 45 kDa, y para las fracciones activas de ferredoxina-NAD+ reductasa, las regiones del gel correspondientes a las proteínas de (i) 41, 37 , y se utilizaron 34 kDa y (ii) a 167 y 53 kDa. Las regiones del gel se cortaron utilizando una punta de pipeta estéril. Luego los tapones de gel se utilizaron para la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas. Cada muestra se sometió a digestión con tripsina y se analizó mediante nano-LC-MS/MS en un CapLC-Q-TOF2 (Waters) y por MALDI en un MALDI MX (Waters). Las proteínas candidatas se identificaron con el software ProteinLynx Global Server (Waters) y Mascot (Matrix Science) utilizando la entrada del Protein Data Bank para C. acetobutylicum. En ambos análisis, para la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, solo se identificó una proteína con una puntuación significativa (77% de cobertura de secuencia). Para la actividad de ferredoxina-NAD+ reductasa, se identificaron cuatro proteínas con puntuaciones significativas: (a) butiril-CoA deshidrogenasa, cobertura de secuencia del 58,6%; (b) EtfB, cobertura de secuencia del 78,4%; (c) GltA, cobertura de secuencia del 78,4%, y (d) GltB, cobertura de secuencia del 50,7%.

La proteína CAC0764 y la proteína del complejo Bcd-EtfB-CST-EtfA se produjeron y purificaron en condiciones anaeróbicas estrictas en forma de proteínas fusionadas Strep-tag II utilizando una columna HP Strep-Trap preempaquetada (Cityva, Suecia). La concentración de destiobiotina en el tampón de elución fue de 7,5 mM de tampón de elución y se añadió FAD 25 μM a todos los tampones33.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y en su archivo de información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Jones, DT Fermentación aplicada de acetona-butanol. en Clostridia: biotecnología y aplicaciones médicas (eds Bahl, H. & Dürre, P.) 125–168 (Wiley-VCH Verlag GmbH, 2001).

Jones, DT & Woods, DR Revisión de la fermentación de acetona-butanol. Microbiol. Rev. 50, 484–524 (1986).

Artículo CAS Google Scholar

Jones, DT y cols. Producción de disolventes y cambios morfológicos en Clostridium acetobutylicum. Aplica. Reinar. Microbiol. 43, 1434-1439 (1982).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Dürre, P. Biobutanol: un biocombustible atractivo. Biotecnología. J. 2, 1525-1534 (2007).

Artículo de Google Scholar

Ni, Y. & Sun, Z. Progresos recientes en la producción fermentativa industrial de acetona-butanol-etanol por Clostridium acetobutylicum en China. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 83, 415–423 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Vasconcelos, I., Girbal, L. y Soucaille, P. Regulación del flujo de carbono y electrones en Clostridium acetobutylicum cultivado en cultivo quimiostato a pH neutro en mezclas de glucosa y glicerol. J. Bacteriol. 176, 1443-1450 (1994).

Artículo CAS Google Scholar

Girbal, L. y Soucaille, P. Regulación del metabolismo de Clostridium acetobutylicum según lo revelado por cultivos continuos en estado estacionario con sustrato mixto: papel de la relación NADH/NAD y el conjunto de ATP. J. Bacteriol. 176, 6433–6438 (1994).

Artículo CAS Google Scholar

Girbal, L., Vasconcelos, I., Saint-Amans, S. y Soucaille, P. Cómo fluyen el carbono y los electrones modificados con rojo neutro en Clostridium acetobutylicum cultivado en cultivo quimiostato a pH neutro. Microbiol FEMS. Rev. 16, 151–162 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Girbal, L., Croux, C., Vasconcelos, I. y Soucaille, P. Regulación de los cambios metabólicos en Clostridium acetobutylicum ATCC 824. FEMS Microbiol. Rev. 17, 287–297 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Girbal, L. & Soucaille, P. Regulación de la producción de disolventes en Clostridium acetobutylicum. Tendencias Biotecnología. 16, 11-16 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Wiesenborn, DP, Rudolph, FB & Papoutsakis, ET Fosfotransbutirilasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 y su papel en la acidogénesis. Aplica. Reinar. Microbiol. 55, 317–322 (1989a).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Wiesenborn, DP, Rudolph, FB & Papoutsakis, ET Coenzima A transferasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 y su papel en la absorción de ácidos. Aplica. Reinar. Microbiol. 55, 323–329 (1989b).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Sauer, U. & Dürre, P. Inducción diferencial de genes relacionados con la formación de disolventes durante el cambio de acidogénesis a solventogénesis en cultivo continuo de Clostridium acetobutylicum. Microbiol FEMS. Letón. 125, 115-120 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Soni, BK, Soucaille, P. & Goma, G. Fermentación continua de acetona butanol: un enfoque global para la mejora de la productividad de los disolventes. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 25, 317–321 (1987).

Artículo CAS Google Scholar

Soni, BK, Soucaille, P. & Goma, G. Fermentación continua de acetona-butanol: influencia de las vitaminas en la actividad metabólica de Clostridium acetobutylicum. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 27, 1–5 (1987).

Artículo CAS Google Scholar

Jang, YS y cols. Producción mejorada de butanol obtenida reforzando la ruta directa de formación de butanol en Clostridium acetobutylicum. mBio 3, e00314–12 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Dusséaux, S., Croux, C., Soucaille, P. & Meynial-Salles, I. Ingeniería metabólica de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 para la producción de alto rendimiento de un biocombustible compuesto de una mezcla de isopropanol/butanol/etanol. Metab. Ing. 18, 1–8 (2013).

Artículo de Google Scholar

Nguyen, NPT, Raynaud, C., Meynial-Salles, I. y Soucaiille, P. Reviviendo el proceso Weizmann para la producción comercial de n-butanol. Nat. Comunitario. 9, 3682 (2018).

ADS del artículo Google Scholar

Yoo, M. et al. Una caracterización cuantitativa a escala de sistema del metabolismo de Clostridium acetobutylicum. mBio 6, e01808–e01815 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Petitdemange, H., Cherrier, C., Raval, G. & Gay, R. Regulación de la ferredoxina oxidorreductasa NADH y NADPH en Clostridia del grupo butírico. Biochim. Biofísica. Actas 421, 334–347 (1976).

Artículo CAS Google Scholar

Lee, J., Yun, H., Feist, A., Palsson, B. & Lee, SY Reconstrucción a escala genómica y análisis in silico de la red metabólica de Clostridium acetobutylicum ATCC824. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 80, 849–862 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Ceccarelli, EA, Arakaki, AK, Cortez, N. & Carrillo, N. Plasticidad funcional y eficiencia catalítica en ferredoxina-NADP(H) reductasas vegetales y bacterianas. Biochim. Biofísica. Acta 1698, 155-165 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Müller, V., Chowdhury, NP y Basen, M. Bifurcación de electrones: un mecanismo de acoplamiento de energía oculto durante mucho tiempo. Año. Rev. Microbiol. 72, 331–353 (2018).

Artículo de Google Scholar

Liang, J., Huang, H. & Wang, S. Distribución, evolución, mecanismo catalítico y funciones fisiológicas de la ferredoxina reducida dependiente de NADH que se bifurca con electrones a base de flavina: NADP + oxidorreductasa. Frente. Microbiol. 10, 373 (2019).

Artículo de Google Scholar

Lo, J. et al. Eliminación de nfnAB en Thermoanaerobacterium saccharolyticum y su efecto sobre el metabolismo. J. Bacteriol. 197, 2920–2929 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Corona, SB y col. Resolución del ciclo del TCA y la vía de las pentosas-fosfato de Clostridium acetobutylicum ATCC 824: análisis de isotopómeros, actividades in vitro y análisis de expresión. Biotecnología. J. 6, 300–305 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Poehlein, A. y col. Formación de disolventes microbianos revisada mediante análisis comparativo del genoma. Biotecnología. Biocombustibles 10, 58 (2017).

Artículo de Google Scholar

Heap, JT, Pennington, OJ, Cartman, ST, Carter, GP y Minton, NP ClosTron: un sistema universal de eliminación de genes para el género Clostridium. J. Microbiol. Métodos 70, 452–464 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Croux, C. y col. Construcción de un mutante sin restricciones ni marcadores útil para la ingeniería metabólica y genómica funcional del productor de biocombustibles Clostridium acetobutylicum. Biotecnología. Biocombustibles 9, 23 (2016).

Artículo de Google Scholar

Jones, SW y cols. El programa transcripcional subyacente a la fisiología de la esporulación clostridial. Genoma Biol. 9, R114 (2008).

Artículo de Google Scholar

Papoutsakis, ET Ecuaciones y cálculos para fermentaciones de bacterias del ácido butírico. Biotecnología. Bioeng. 26, 174–187 (1983).

Artículo de Google Scholar

Demuez, M., Cournac, L., Guerrini, O., Soucaille, P. y Girbal, L. Perfil de actividad completo de Clostridium acetobutylicum [FeFe]-hidrogenasa y parámetros cinéticos para socios redox endógenos. Microbiol FEMS. Letón. 275, 113-121 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Gauquelin, C. y col. Funciones del dominio F en la [FeFe] hidrogenasa. Biochim. Biofísica. Acta 1859, 69–77 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, S., Huang, H., Moll, J. & Thauer, RK La reducción de NADP+ con ferredoxina reducida y la reducción de NADP+ con NADH se acoplan mediante un complejo enzimático bifurcador de electrones en Clostridium kluyveri. J. Bacteriol. 192, 15115–15123 (2010).

Google Académico

Bradford, M. Un método rápido y sensible para la cuantificación de cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión proteína-tinte. Anal. Bioquímica. 72, 248–254 (1976).

Artículo CAS Google Scholar

Meynial-Salles, I. et al. Ingeniería metabólica de Clostridium acetobutylicum para la producción industrial de 1,3-propanodiol a partir de glicerol. Metab. Ing. 7, 329–336 (2005).

Artículo de Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Agence Nationale de la Recherche (becas ANR acetoH2 PNRB 2006 ANR Bio6 BioE-001, Biobutafuel ANR 088 BioE-012-01, Cellutanol ANR 14 CE05-0019-02) y por el Proyecto Europeo BIOCORE (becas nº FP7-241566). Los autores agradecen a AJE por la edición en inglés del documento (código de certificación 3DBE-123F-E411-E361-B16P).

Estos autores contribuyeron igualmente: Céline Foulquier, Antoine Rivière.

TBI, Universidad de Toulouse, CNRS, INRAE, INSA, Toulouse, Francia

Céline Foulquier, Antoine Rivière, Mathieu Heulot, Suzanna Dos Reis, Caroline Perdu, Laurence Girbal, Mailys Pinault, Simon Dusséaux, Minyeong Yoo, Philippe Soucaille e Isabelle Meynial-Salles

BBSRC/EPSRC Centro de Investigación de Biología Sintética, Facultad de Ciencias de la Vida, Centro de Ciencias Biomoleculares, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Minyeong Yoo y Philippe Soucaille

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

CF, AR, MH, MY, SDR, CP, MP y SD diseñaron y realizaron los experimentos. LG participó en la concepción de este estudio. PS e IMS concibieron este estudio, analizaron los datos, discutieron los resultados y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Philippe Soucaille.

Se presentó una solicitud de patente en 2015 con las siguientes referencias: Soucaille P., Meynial-Salles I., Foulquier C. y Rivière A presentaron una solicitud de patente (solicitud de patente europea EP15306225) en 2015 con el título “Nuevo polipéptido que tiene ferredoxina -Polinucleótido con actividad NADP+ reductasa que codifica el mismo y usos del mismo”. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a Milagros Medina, Chen Yang y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Foulquier, C., Rivière, A., Heulot, M. et al. Caracterización molecular de las vías de electrones faltantes para la síntesis de butanol en Clostridium acetobutylicum. Nat Comuna 13, 4691 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32269-1

Descargar cita

Recibido: 06 de septiembre de 2021

Aceptado: 22 de julio de 2022

Publicado: 10 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32269-1

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.