Estudio de microfluidos en un medidor. | Cuentas de cuarzo Weifang Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 19553 (2022) Citar este artículo

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La precipitación de carbonato de calcio (CaCO3) (MICP) inducida microbianamente es una de las principales alternativas sostenibles a la cementación artificial de medios granulares. MICP consiste en inyectar secuencialmente al suelo soluciones ricas en calcio y bacterias para formar enlaces de calcita entre las partículas del suelo que mejoran la resistencia y rigidez de los suelos. El rendimiento de MICP se rige por los procesos subyacentes a microescala de crecimiento bacteriano, transporte reactivo de solutos, velocidades de reacción, nucleación y crecimiento de cristales. Sin embargo, no se comprende bien el impacto de la heterogeneidad de la escala de poros en estos procesos durante MICP. Este artículo arroja luz sobre el efecto de la heterogeneidad a escala de poro en la evolución espaciotemporal de MICP, la eficiencia general de la reacción química y la evolución de la permeabilidad mediante la combinación de dos dispositivos de microfluidos de un metro de largo de idénticas dimensiones y porosidad con redes porosas homogéneas y heterogéneas y monitoreo en tiempo real. . Los dos chips recibieron, por triplicado, tratamiento MICP con un flujo impuesto y las mismas condiciones iniciales, mientras que las presiones de entrada y salida fueron monitoreadas periódicamente. Este artículo propone un flujo de trabajo integral destinado a detectar bacterias y cristales a partir de datos de microscopía de lapso de tiempo en múltiples posiciones a lo largo de una réplica de microfluidos de medios porosos tratados con MICP. Se formaron cristales de CaCO3 1 h después de la introducción de la solución de cementación (CS), y el crecimiento de los cristales se completó 12 h después. La tasa promedio de crecimiento de cristales fue en general mayor en el medio poroso heterogéneo, mientras que se volvió más lenta después de las primeras 3 h de inyección de cementación. Se encontró que la eficiencia promedio de la reacción química presentó un pico del 34% en la mitad del chip y se mantuvo por encima del 20% antes de los últimos 90 mm del camino reactivo para la red porosa heterogénea. El medio poroso homogéneo presentó una eficiencia de reacción promedio general más baja, que alcanzó un máximo del 27% a 420 mm aguas abajo de la entrada y se mantuvo por debajo del 12% para el resto del canal de microfluidos. Estas diferentes tendencias de eficiencia química en las dos redes se deben a un mayor número de cristales de mayor diámetro promedio en el medio heterogéneo que en el medio poroso homogéneo. En el intervalo entre 480 y 900 mm, el número de cristales en el medio poroso heterogéneo es más del doble que el número de cristales en el medio poroso homogéneo. Los diámetros promedio de los cristales fueron de 23 a 46 μm en el medio poroso heterogéneo, en comparación con 17 a 40 μm en el medio poroso homogéneo en todo el chip. La permeabilidad del medio poroso heterogéneo se vio más afectada que la del sistema homogéneo, mientras que los sensores de presión capturaron efectivamente una mayor disminución en la permeabilidad durante las primeras dos horas cuando se formaron los cristales y una disminución menos prominente durante el posterior crecimiento sembrado del cristales existentes, así como la nucleación y crecimiento de nuevos cristales.

Durante la última década, la precipitación de carbonato de calcio (CaCO3) (MICP) inducida microbianamente ha surgido como una alternativa sostenible a la estabilización tradicional del suelo basada en cemento Portland ordinario1. MICP ha sido estudiado para una variedad de posibles aplicaciones de ingeniería, como la mejora del suelo para aumentar la rigidez y resistencia2,3,4 de suelos granulares, comúnmente conocido como biogrouting5; inmovilización de metales pesados y radionucleidos6; Secuestro de CO27 y sellado de fracturas en pozos de secuestro de CO2 para mitigar las fugas8. La MICP basada en ureólisis, que es el mecanismo más estudiado, se produce en dos etapas. En la primera etapa, los microorganismos ureolíticos del suelo, es decir, las bacterias que secretan la enzima ureasa, catalizan la hidrólisis de la urea (Ec. 1). Esta reacción produce iones amonio (NH4+) que aumentan el pH del microambiente, así como iones carbonato (CO32–). En consecuencia, la alcalinidad favorece la precipitación de CaCO3 en presencia de suficientes iones calcio (Ec. 2):

El microorganismo más comúnmente utilizado en estudios de MICP mediante ureólisis es Sporosarcina pasturii (S. pasturii) (designación de cepa ATCC 11859) porque es una cepa no patógena que ha demostrado una mayor actividad de ureasa que muchas otras cepas9. Sporosarcina pasteurii pertenece al género Bacillus, que se caracteriza por ser una bacteria Gram positiva, formadora de endosporas y aeróbica10. Las células tienen un potencial zeta negativo que atrae iones calcio, favoreciendo así la nucleación heterogénea11. La nucleación heterogénea o sembrada se refiere a la precipitación en superficies como células, burbujas de gas12 y minerales13,14, que reducen las barreras de energía necesarias para la nucleación y aumentan la velocidad de nucleación. Por el contrario, la nucleación homogénea se refiere a la precipitación de CaCO3 a partir de soluciones de cristalización. Por lo tanto, el mecanismo de precipitación en MICP puede ser inducido de dos maneras diferentes: (i) por bacterias que actúan como sitios de nucleación, es decir, vía precipitación epicelular, y (ii) por el aumento del pH alrededor de las células ureolíticas debido a la urea antes mencionada. reacción de hidrólisis15.

El CaCO3 precipitado llena los espacios porosos de los medios granulares y, lo más importante, les confiere una verdadera cohesión al unir los granos del suelo, lo que en última instancia conduce a una mayor resistencia al corte y rigidez2. La precipitación de CaCO3 disminuye la porosidad y permeabilidad de los suelos. La disminución de la permeabilidad debido al tratamiento MICP es inferior a 1 a 3 órdenes de magnitud en la mayoría de los casos, lo cual es una ventaja de MICP en comparación con las lechadas químicas que pueden reducir la permeabilidad hasta 8 órdenes de magnitud16.

La entrega uniforme de reactivos a distancia es importante para la remediación de grandes zonas objetivo en la aplicación de campo de MICP17,18. Una tasa de precipitación más alta puede provocar obstrucciones cerca del punto de inyección, mientras que con una tasa de precipitación más baja, se puede lograr una mayor uniformidad. Las concentraciones químicas variables de urea y cloruro de calcio en la solución de cementación (CS) afectan la tasa de precipitación y los patrones, causando heterogeneidades a microescala. Los tamaños, formas y distribución espacial del CaCO3 precipitado en el espacio poroso pueden causar diferencias en la permeabilidad y resistencia a macroescala de los suelos biocementados19. Por ejemplo, Al Qabany y Soga19 demostraron que para CS altamente concentrado de urea-cloruro de calcio 1 M19, se formaban cristales más grandes que obstruían los poros, lo que llevaba a una disminución más rápida de la permeabilidad y a faltas de homogeneidad en la precipitación. Otro factor que afecta la tasa de precipitación es el tamaño y la gradación de las partículas del suelo17. La precipitación de CaCO3 es más efectiva en los contactos de partículas17. Mortensen et al. 17 reportaron una mayor tasa de precipitación en arenas densas, bien graduadas y más gruesas que en suelos sueltos, más finos y pobremente graduados, lo que se atribuyó predominantemente a las propiedades intrínsecas del material base sujeto a MICP.

La eficiencia de la reacción química, que se define como el porcentaje de calcio y urea inyectados que se convierte en CaCO3, es un parámetro importante a controlar durante la aplicación a escala de campo de MICP para evitar el desperdicio de materias primas20. Al Qabany et al.21 investigaron los factores que afectan la eficiencia a escala de columna, como la concentración química en la CS, la duración del tratamiento y la tasa de entrada efectiva, que se definió como la relación entre la concentración química y la falta de flujo. tiempo permitido para la reacción (el tiempo de retención). Se encontró que para una DO600 de 0,8 a 1,2, la tasa de entrada efectiva de 0,042 mol/L/h dio como resultado una eficiencia de reacción superior al 80 % para todas las muestras de arena, independientemente de la concentración química utilizada (0,25 a 0,5 a 1 M de urea). -cloruro de calcio). Zeng et al.22 informaron una eficiencia química muy baja del 5% en un experimento a escala de campo, que se atribuyó a rutas de flujo preferenciales, canalizando los reactivos hacia zonas específicas de la matriz del suelo (lentes de arena).

Tradicionalmente, las muestras biocementadas se observan mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), que requiere un muestreo destructivo posterior al tratamiento para proporcionar información cualitativa detallada sobre la estructura y textura de los suelos biocementados23. En los últimos años, se han desarrollado configuraciones experimentales que combinan microfluidos e imágenes para investigar procesos a microescala de MICP23,24,25,26,27,28,29 y precipitación de calcita inducida enzimáticamente (EICP)30,31 en tiempo real. Los dispositivos de microfluidos integran redes porosas (conocidas como laboratorio en un chip) y facilitan la obtención de imágenes y el seguimiento. Permiten la visualización de procesos de transporte a microescala debido a su transparencia y pequeño espesor y se usan comúnmente para aplicaciones en investigación biomédica32, investigación de monitoreo de agua33, transporte de bacterias en medios porosos34 y recuperación mejorada de petróleo35. Otra tecnología que se ha utilizado para estudiar la nucleación y el crecimiento de monocristales es la microfluídica de gotas36. Utilizando esta configuración, los autores pudieron investigar la encapsulación de células mediante cristales, lo cual es fundamental en términos de disponibilidad de células activas para la continuación de la ureólisis. Teniendo en cuenta lo anterior, el uso de un laboratorio en un chip para estudios MICP permite una serie de observaciones en tiempo real, que incluyen (i) cuantificación de bacterias, (ii) cuantificación de cristales de CaCO3 y (iii) determinación. de sus formas.

Xiao et al.27 utilizaron un chip de microfluidos en forma de Y hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) con dos puertos de entrada para la inyección simultánea de la suspensión bacteriana (BS) y CS que convergieron en un canal de microfluidos de reacción de red de poros homogéneos. . Las imágenes capturadas en un área de 2,8 mm por 4,5 mm (WxL) del chip mostraron que CaCO3 precipitó primero en el lado de la inyección de BS y luego en el lado de la inyección de CS. Además, en el estudio de Xiao et al.29 se exploró el efecto de diferentes concentraciones de cloruro de calcio sobre la difusión y movilidad de las bacterias, la cinética de crecimiento de los cristales y la distribución de los cristales en MICP. Los resultados mostraron que una concentración de 0,5 M reducía la movilidad de las bacterias, restringiéndolas al lado de la inyección de BS. Por otro lado, con una concentración de 0,01 M, se logró una distribución más homogénea de las bacterias en todo el ancho del chip al final del tratamiento MICP, lo que también condujo a una distribución más homogénea de los cristales.

Wang et al.24,25,26,28 utilizaron un microfluido PDMS con dimensiones de 15 mm por 15 mm, diseñado en base a imágenes transversales de un suelo arenoso 3D Ottawa 30–50 solidificado y seccionado. Wang et al.26 demostraron que una mayor densidad bacteriana daba como resultado un mayor número general de cristales y una tasa de crecimiento cristalino más rápida. Más precisamente, la densidad bacteriana más alta (~5,2 × 108 células/mL) produjo 2 × 107 cristales/mL, con un volumen de cristal promedio de 450 μm3, mientras que la densidad bacteriana más baja (~0,6 × 108 células/mL) produjo una densidad más baja. cantidad de cristales (1,1 × 106 cristales/mL) pero un volumen promedio mayor de 8000 μm3. El crecimiento de cristales concluyó a las 1,5 h cuando la densidad bacteriana era de 5,2 × 108 células/ml, mientras que una concentración bacteriana 10 veces menor dio como resultado 15 h de crecimiento de cristales. Wang et al.28 hicieron el primer intento publicado de utilizar los resultados de experimentos con microfluidos para optimizar los experimentos en columna. Más específicamente, los experimentos de microfluidos proporcionaron información sobre el tamaño y la cantidad de cristales para intervalos de inyección bajos (3 a 5 h) y altos (24 h) que también se observaron en los experimentos de la columna y fueron críticos para la eficiencia del proceso de MICP y el Resistencia mecánica de los suelos tratados.

Kim et al.30 utilizaron un dispositivo de microfluidos de vidrio homogéneo, con dimensiones de 21,3 mm por 12,7 mm y exploraron la cinética de precipitación para el tratamiento multiciclo con EICP. Un algoritmo integral de análisis de imágenes para segmentar la estructura de los poros y el CaCO3 precipitado. Hasta donde sabemos, el trabajo de Kim et al.30 es el primero en comparar la tasa de nucleación observada durante el experimento en el micromodelo, que simula las condiciones de mala mezcla en un medio poroso homogéneo, con la nucleación predicha. tasa basada en la teoría clásica de la nucleación. Dado que los microfluidos solo permiten obtener imágenes en 2D, fue necesario hacer suposiciones sobre la forma de los cristales (esféricos y semiesféricos) para evaluar el crecimiento del cristal en tres dimensiones. Weinhardt et al.31,37 presentaron una configuración experimental para la medición robusta de la presión en canales de microfluidos PDMS de geometrías de estructura de poros cuasi 1D y cuasi 2D y pocos mm de longitud durante la precipitación de CaCO3 mediante EICP y observaron la influencia de la geometría en la porosidad-permeabilidad. relación. El uso de tomografía microcomputada de rayos X (XRCT), que resuelve la tercera dimensión de los precipitados de CaCO3 después del final del tratamiento EICP, sugirió que las formas esferoidal y truncada se pueden usar para calcular el volumen de CaCO3 precipitado a partir de proyecciones 2D.

Aunque los estudios anteriores han visualizado una variedad de estrategias de inyección de BS y CS con diferentes intervalos de inyección, densidades bacterianas y concentraciones de CS en dominios microfluídicos de diferentes geometrías en tiempo real, están limitados a un área de unos pocos mm2. Sin embargo, MICP es un fenómeno de transporte reactivo durante el cual los reactivos se consumen a una distancia del punto de inyección y la tasa de desprendimiento de bacterias puede diferir con la distancia. Además, se espera que la heterogeneidad a escala de poros afecte la distribución espacial de los reactivos debido a las zonas de mayor velocidad que pueden transferir bacterias a una distancia más larga. Hasta donde sabemos, aún no se ha estudiado el impacto de la heterogeneidad de la escala de poros en la eficiencia de la reacción química de MICP.

El objetivo de este artículo fue investigar el efecto de la heterogeneidad de la escala de poros sobre la eficiencia de la reacción química de MICP. Se fabricaron dos tipos de microfluidos de un metro de largo con la misma porosidad inicial: microfluidos homogéneos y heterogéneos. Este trabajo introduce una nueva configuración experimental para la evaluación de la eficiencia de la reacción química y la comparación del efecto de la masa de CaCO3 precipitado producida sobre la permeabilidad de medios porosos homogéneos y heterogéneos. La precipitación de CaCO3 se monitorizó tanto temporal como espacialmente en diferentes lugares a lo largo del camino de un metro de longitud, lo que permitió conocer la escala de los poros. Se desarrolló un algoritmo de procesamiento de imágenes para analizar las imágenes experimentales y detectar el número de bacterias, así como la nucleación y crecimiento de minerales precipitados individuales y aglomerados con respecto al tiempo de reacción y la distribución espacial. A partir de las imágenes procesadas, se realizó un análisis estadístico exhaustivo para estimar la distribución de las bacterias y los cristales a lo largo de todo el chip, que abarca más de diez mil poros, para identificar patrones de precipitación distintivos para las dos geometrías.

Para evaluar el efecto de la heterogeneidad a escala de poro, desarrollamos una configuración experimental integral (Fig. 1a) que utiliza un dispositivo de microfluidos muy largo que cubre varios órdenes de magnitud en el tamaño de poro promedio que colocamos en un portaobjetos de vidrio para microscopio de 75 mm por 50 mm, como se muestra en la Fig. 1b, c. La misma estrategia de inyección se aplicó a dos geometrías microporosas diferentes con la misma porosidad (n = 0,5) por triplicado: una homogénea (mismo tamaño de poro en todo el chip) y otra heterogénea, es decir, con distancias espacialmente variables entre granos. La primera geometría consistía en una red regular de granos sólidos cilíndricos idénticos, con un tamaño de garganta de poro (λ1) igual a 50 μm (Fig. 1b), mientras que la segunda geometría consistía en granos sólidos distribuidos irregularmente, con tamaños de garganta de poro que oscilaban entre 25 y 50 μm. a 350 μm, con un promedio de λ2 = 70 μm (Fig. 1c)38. Estos medios porosos artificiales tienen L = 990 mm de largo, W = 3 mm de ancho y H = 0,050 mm de espesor, correspondientes a L = 19800λ1, W = 60λ1 y H = λ1 para el medio poroso homogéneo y L = 14143λ2, W = 43λ2 y H = 0,7λ2 para el medio poroso heterogéneo.

(a) Representación esquemática de la configuración experimental. La estrategia de inyección implica (1) la inyección de agua Milli-Q desde la salida, (2) la inyección de BS desde la salida y (3) la inyección de CS desde la entrada. PS1 y PS2 indican los sensores de presión conectados en la entrada y salida, respectivamente. Creado con BioRender.com; (b) diseño de microfluidos de un medio poroso homogéneo; (c) diseño microfluídico de un medio poroso heterogéneo.

Los chips de microfluidos se fabricaron mediante un proceso de fotolitografía suave estándar. El dispositivo PDMS se produjo según el protocolo descrito por Karadimitriou y Hassanizadeh39. La base PDMS se mezcló completamente con el agente de curado en una proporción de 10:1. Posteriormente, la mezcla se desgasificó al vacío antes de verterla en el molde y curarla durante al menos 4 h en el horno a 60 °C. Después de retirar el canal de microfluidos PDMS del molde, se perforaron entradas y salidas de 1,2 mm de diámetro. Tanto el chip PDMS como la cubierta de vidrio se trataron con plasma, lo que hace que la superficie del PDMS sea hidrófila26 como la arena. Luego, el chip se unió a la cubierta de vidrio y se colocó en una placa caliente a 100 °C durante al menos 30 minutos para asegurar una unión fuerte y permanente. Posteriormente, el chip de microfluidos se colocó en un desecador para desgasificar el PDMS durante aproximadamente 30 minutos, lo que garantiza la eliminación de las burbujas absorbidas por el PDMS durante la saturación del chip. Como material ligeramente permeable a los gases, el PDMS permite el crecimiento aeróbico de S. pasteurii. Sin embargo, cuando los experimentos se realizan durante mucho tiempo, el agua puede evaporarse40. Por lo tanto, se eligió una estrategia de inyección para que los experimentos duraran menos de 24 h.

En el estudio actual, se utilizó medio de crecimiento microbiano líquido (American Type Culture Collection (ATCC) 1376), que consistía en 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de sulfato de amonio y 0,13 mol/L de solución acuosa de tampón Tris con un pH inicial. de 9, esterilizadas por separado y luego mezcladas. Sporosarcina pasteurii almacenada a -80 °C se inoculó en 4 ml de medio de crecimiento ATCC 1376 fresco. Las células bacterianas se cultivaron en una incubadora con agitación a 180 rpm a 30 °C durante 48 h para alcanzar condiciones estacionarias. La densidad óptica (DO) se midió con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm (OD600). La suspensión bacteriana (BS) utilizada en los estudios de microfluidos se obtuvo diluyendo41 para alcanzar una densidad óptica de 0,4 a 0,55. Se preparó una solución de cementación (CS) diluyendo concentraciones equimolares (1 mol/L) de urea (CH4N2O) con una molaridad de 60,06 g/mol y cloruro de calcio (CaCl2) (anhidro Sigma-Aldrich) con una molaridad de 110,98 g/mol. mol en agua Milli-Q.

Los experimentos se realizaron en un ambiente bien controlado con una temperatura de 25 ± 1 °C. A continuación, explicamos en detalle la estrategia de inyección, que consta de tres inyecciones secuenciales: (i) saturación del chip con agua MIlliQ, (ii) inyección de BS y (iii) inyección de CS, durante las cuales se modifica ligeramente la configuración experimental. como se explica a continuación (Fig. 1a). La inyección de BS y CS utilizando el mismo tubo daría como resultado la mezcla de las dos soluciones y, posteriormente, la ureólisis y la precipitación dentro del tubo, que tiene una sección transversal más grande en comparación con la configuración de microfluidos. Por lo tanto, la precipitación resultante no sería representativa de la distribución espacial a lo largo de 1 m de distancia. Por lo tanto, el agua Milli-Q utilizada y el BS se inyectaron desde la salida del canal de microfluidos ("salida" en la Fig. 1b, c), mientras que el CS se inyectó desde la entrada ("entrada" en la Fig. 1b, c). ). Se colocaron sensores de presión de alta precisión (Elveflow MPS-S-1 con un rango de trabajo de 340 mbar en la entrada y Elveflow MPS-S-0 con un rango de trabajo de 70 mbar en la salida) en serie con el flujo cerca de 7 cm. desde la entrada y 4 cm desde la salida. Los sensores permitieron estimar la diferencia de presión entre los dos puntos en condiciones de flujo durante la inyección de CS, así como durante la fase de precipitación y retención sin flujo. Los sensores de presión se fijaron en la platina del microscopio con cinta adhesiva y se conectaron a un controlador de presión Elveflow OB142. El chip de microfluidos desgasificado se colocó horizontalmente en el escenario.

La Tabla 1 presenta la composición de BS y CS y la estrategia de inyección seleccionada. Para la saturación del chip de microfluidos con agua Milli-Q, el sensor de presión cerca de la salida se conectó a la salida y a una jeringa de vidrio (Hamilton) con agua Milli-Q de 1 a 10 ml montada en una bomba de jeringa (Harvard Apparatus ), mientras que la entrada permaneció abierta al aire. Para todas las conexiones se utilizó tubería Tygon de 1/16″. El chip se saturó con dos volúmenes de poros de agua Milli-Q a un caudal de 0,2 μL/s. Al final de la inyección, se observó una pequeña burbuja de agua en la entrada para que el aire no penetrara en el chip de microfluidos. Posteriormente se dejó un intervalo de tiempo de 30 min hasta el siguiente paso para que las burbujas de gas fueran absorbidas por el PDMS.

Después de la saturación total del chip de microfluidos, se inyectó la BS desde la salida. Para ello, la jeringa que contenía el agua Milli-Q fue reemplazada por una jeringa Hamilton de vidrio de 5 ml que contenía BS. La inyección bacteriana de 500 μL (aproximadamente 7 volúmenes de poros de chip de 75 μL) duró 40 minutos para lograr una distribución aproximadamente homogénea de las bacterias a lo largo de todo el chip.

Al final de la fase de inyección bacteriana, mientras las células se asentaban, se seleccionaron diecinueve posiciones a lo largo del canal para las observaciones. Este paso duró aproximadamente 1 h, en el que fue necesario fijar las posiciones y enfoque de las 19 ubicaciones diferentes. Durante este tiempo, las células crecieron desde la DO600 inicial de 0,40 a 0,55 antes de la inyección. Por lo tanto, capturamos imágenes en t = 0, que corresponde al inicio de la inyección de cementación y puede representar la concentración bacteriana inicial. Para inyectar CS desde la entrada, primero se retiró con cuidado la jeringa de vidrio conectada a la salida y el tubo de salida se colocó en un tubo Falcon de 50 ml para la recolección del efluente. El tubo Falcon contenía 50 ml de agua Milli-Q y se cubrió con parafilm y papel de aluminio durante las condiciones de inyección y sin flujo para evitar la evaporación y garantizar un flujo constante/sin flujo, respectivamente. La hidrólisis de la urea comenzó en la entrada tan pronto como se conectó el tubo que contenía el CS al dispositivo de chip, ya saturado con BS. Luego, se montó una jeringa Hamilton de vidrio de 10 ml en la bomba de jeringa y se conectó a través del sensor de presión al tubo de entrada (Fig. 1a). Antes de conectar el tubo de entrada al canal, se saturó completamente para que apareciera una gota de líquido en el extremo del tubo para garantizar la saturación total al momento de la conexión. La inyección de cemento se realizó con un caudal de 0,018 μL/s, lo que corresponde a una velocidad de filtración de 0,24 mm/s, igual a la velocidad de filtración calculada para una muestra de arena preparada en laboratorio con una altura de 10 cm y un diámetro de 5 cm. , y porosidad de 0,4, que se inyectó a un caudal de 10 ml/min4. El tiempo de retención de CS fue de 12 a 24 h. El caudal aplicado corresponde a un número de Reynolds de \(Re = \frac{{\rho \overline{\lambda }\overline{u}}}{\mu } \ll 1\) (Tabla S1), donde \( \uprho\) es la densidad del agua (kg m−3), \(\overline{\lambda }\) es el tamaño promedio de la garganta de los poros (m), \(\overline{u}\) es la velocidad promedio del fluido ( ms−1) y \(\mu\) es la viscosidad dinámica del agua (kg m−1 s−1). Por lo tanto, el flujo en el chip se puede caracterizar como flujo progresivo, también conocido como flujo de Stokes, que está dominado por fuerzas viscosas. Se inyectaron 6 volúmenes de poros de chip de CS durante 6,75 h, período durante el cual la nucleación y el crecimiento de los cristales se capturaron bajo el suministro de solución nueva y continuaron durante el período de retención. A modo de comparación, Xiao et al.29 informaron que un solo paso de inyección constaba de 7 volúmenes de poros de astillas, mientras que Kim et al.30 implementaron un tratamiento de 10 ciclos en el que cada ciclo constaba de aproximadamente 100 volúmenes de poros y se repetía en un intervalo de 48 h. Sin embargo, estos trabajos se refieren a chips mucho más cortos y la inyección de un único volumen de poro requirió sólo unos minutos.

Las imágenes de lapso de tiempo se realizaron mediante un microscopio Nikon Eclipse Ti2 invertido totalmente automatizado (Objetivo de contraste de fase Plan Fluor 10 ×) equipado con una cámara digital en color Nikon DS-Ri2 y controlado por el software NIS-Elements. Se registraron imágenes grandes, compuestas por 9 imágenes en mosaico con un tamaño de 8813 píxeles (2,57 mm en la dirección transversal) por 13252 píxeles (3,87 mm en la dirección longitudinal) y campos de 3 × 3 en 19 posiciones a lo largo del camino (Fig. 2a ) con dos configuraciones diferentes, contraste de fase (Fig. 2b) y campo claro (Fig. 2c). Las 19 posiciones muestreadas incluyeron los orificios de entrada y salida, 3 posiciones (izquierda, centro, derecha) cerca de la entrada y salida, y en el medio de cada fila. Las imágenes se capturaron con microscopía de contraste de fase modificada (un anillo ph3 combinado con un objetivo ph1 para que la iluminación se produzca casi lateralmente), lo que dio como resultado un fondo oscuro con las bacterias ligeramente más brillantes y los cristales apareciendo brillantes. Por el contrario, en las imágenes capturadas con una configuración de microscopía de campo claro (sin condensador), el contorno de los cristales aparece oscuro, mientras que las bacterias y el fondo aparecen brillantes. El tiempo de exposición de la cámara se configuró en 50 ms para las imágenes de contraste de fase y en 2 ms para las imágenes de campo claro. Utilizamos una alta resolución de 0,29 μm/píxel para observar tanto las bacterias como los cristales. Como se mencionó anteriormente, las posiciones se seleccionaron durante la sedimentación bacteriana, mientras que el enfoque se realizó en base a células inmóviles individuales que residen en la parte inferior del chip (en el portaobjetos de vidrio). La duración de la inyección de un volumen de poro de CS fue de aproximadamente 62 minutos, mientras que el sistema de adquisición tardó 10 minutos en recopilar imágenes desde la posición 1 a la posición 19 con las dos configuraciones ópticas antes mencionadas. Para optimizar el tiempo de cálculo de las grandes series de datos recopilados, el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes fue de 1 h durante las condiciones de flujo y de 2 h durante la fase de retención, ya que se esperaba una tasa de crecimiento más lenta. Por tanto, se monitorizó en tiempo real la evolución temporal de MICP en el chip de microfluidos.

(a) Posiciones muestreadas; (b) Sección de dimensiones 1.022 mm × 1.022 mm del canal verde de la imagen original capturada con microscopía de contraste de fase y (c) del canal verde de la imagen original capturada con microscopía de contraste de fase.

Desarrollamos un algoritmo integral de procesamiento de imágenes en lenguaje MATLAB para identificar el CaCO3 precipitado y las bacterias a partir del procesamiento combinado de los dos tipos de imágenes sin procesar (contraste de fases y campo claro).

Una imagen experimental sin procesar es una imagen en color RGB de 24 bits, que consta de tres matrices de 8813 × 13,252, cada una de las cuales representa los colores rojo, verde y azul. Cada matriz contiene valores que van desde 0 (negro) hasta 255 (blanco). Los tres canales se extrajeron por separado como imágenes en escala de grises de 8 bits con el uso del software NIS Elements (Figs. S1, S2). Determinamos que las células bacterianas tienen la mayor intensidad en el canal verde (Fig. S1), mientras que los cristales también exhiben la máxima absorbancia en el canal verde (Fig. S2). Por lo tanto, solo los canales verdes de las imágenes adquiridas se procesaron adicionalmente para segmentar la estructura del medio sólido (los granos), las bacterias y el CaCO3 precipitado. Después de la conexión del tubo en la entrada y la inyección de CS, se formaron grandes agregados bacterianos cerca de la entrada debido a la unión de iones de calcio cargados positivamente a las células de S. pasteurii cargadas negativamente26 (Fig. S3). La intensidad de estos agregados es similar a la del CaCO3 precipitado; por lo tanto, las imágenes capturadas más cercanas a la entrada (x = ~5 mm) no se procesaron más.

Como primer paso, se seleccionaron imágenes de cada posición en dos momentos diferentes: (i) el comienzo de la inyección de CS (t = 0), cuando solo se pueden observar bacterias, y (ii) después del final de la inyección de CS. (t = 10 h), cuando se pudieron observar tanto bacterias como cristales. Las imágenes se normalizaron en 255 para que cada píxel tuviera valores entre 0 (píxel oscuro) y 1 (píxel brillante). A continuación, explicamos el flujo de trabajo para detectar las tres fases: granos sólidos, bacterias y minerales CaCO3 precipitados.

Para separar los granos sólidos cilíndricos (es decir, el círculo en nuestras imágenes) de la imagen de campo claro capturada en t = 0 (Fig. 3a), la imagen se binarizó con la función "Imbinarizar" en MATLAB que reemplaza los valores por encima de un umbral adaptativo. con 1 (blanco) y los valores por debajo del umbral con 0 (negro). Este método de umbral adaptativo selecciona un umbral basado en la intensidad media local en la vecindad del píxel. Se utilizó la opción “oscura” “ForegroundPolarity” para detectar los contornos de los pilares, ya que su intensidad es menor que la del fondo. El umbral fue determinado por el parámetro "Sensibilidad", que puede tomar valores de 0 a 1 (consulte el material complementario). Al utilizar una mayor sensibilidad, se definen más píxeles como contornos de los pilares. La imagen binaria resultante consta del perímetro de los granos circulares y las bacterias, así como el ruido dentro de los granos circulares presentados en negro, y el espacio de los poros y el interior de los granos sólidos circulares presentados en blanco (Fig. 3b).

Flujo de trabajo que presenta la extracción de imágenes binarias de los pilares a partir de imágenes de campo claro en t = 0 (a) Sección de dimensiones 1,022 mm × 1,022 mm de la imagen sin procesar del canal verde, (b) Binarización de imágenes, (c) Inversión y filtrado de ruido y bacterias con “bwpropfilt”, (d) Relleno de blanco de los pilares con “imfill”.

Los píxeles que representaban bacterias y ruido dentro de los granos circulares se eliminaron con el uso de la función "bwpropfilt" en la imagen binaria inversa. Como resultado, se creó una imagen binaria con los círculos correspondientes al perímetro de los pilares en blanco y el espacio poroso en negro (Fig. 3c). Finalmente, los granos sólidos circulares se rellenaron con color blanco utilizando "relleno" (Fig. 3d).

Las bacterias se separaron de la imagen de contraste de fase capturada en t = 0 (Fig. 4a). Cada imagen se binarizó con "Imbinarize" con el uso del método de umbral adaptativo, configurando el parámetro "ForegroundPolarity" en la opción "oscuro". El valor de “Sensibilidad” se definió mediante prueba y error entre 0,1 y 0,2 para detectar las bacterias, ya que su intensidad es ligeramente superior a la del fondo y muy inferior a la intensidad del perímetro de pilares y cristales. En la imagen binaria resultante, las bacterias y el perímetro de los pilares se muestran en blanco, mientras que los espacios porosos, así como el interior de los granos circulares, se muestran en negro (Fig. 4b). Posteriormente, configuramos los píxeles que corresponden a los pilares de la imagen binaria previamente adquirida en la Fig. 3d en blanco (Fig. 4c). Finalmente, separamos las bacterias de los pilares filtrando las partículas de un área entre 10 y 900 píxeles2, correspondientes a 2,9–261 μm2, como se define con Image Region Analyzer. Se derivó una imagen binaria donde las bacterias aparecían blancas sobre un fondo negro (Fig. 4d). Las bacterias exhibieron longitudes variables porque crecen después de la división celular (Fig. S4). Se siguió el mismo procedimiento para separar las bacterias en t = 10 h (Fig. 4f – h) de la imagen de contraste de fase capturada en este momento (Fig. 4e).

Flujo de trabajo que presenta la extracción de la imagen binaria de bacterias de la imagen de contraste de fase en t = 0 (a) Sección de dimensiones 1,022 mm × 1,022 mm de la imagen sin procesar del canal verde; (b) Binarización de la imagen, (c) Establezca los píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d en blanco, (d) Retire los pilares con "bwpropfilt"; en t = 10 (e) Imagen sin procesar del canal verde; (f) Binarización de la imagen, (g) Establezca los píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d en blanco, (h) Retire los pilares con "bwpropfilt".

Posteriormente, el CaCO3 precipitado se separó de la imagen de campo claro capturada en t = 10 h (Fig. 5a). Se utilizó el método de umbral adaptativo, estableciendo el parámetro “ForegroundPolarity” en la opción “Imbinarize” en “dark”. La "sensibilidad" se definió mediante prueba y error entre 0,4 y 0,5 para detectar el perímetro del CaCO3 precipitado. En la imagen binaria resultante, el perímetro del cristal, los pilares y algunas bacterias aparecieron en blanco, mientras que el fluido de los poros y el interior de los granos circulares aparecieron en negro (Fig. 5b). La función "Imclose" de MATLAB se utilizó para suavizar los bordes de los contornos de los cristales y cerrar los agujeros existentes (Fig. 5c). Luego, usamos la función "rellenar" para llenar los cristales y los pilares con blanco (Fig. 5d). Además, los píxeles correspondientes a los pilares en la Fig. 3d se igualaron a cero. Luego, la imagen binaria de la Fig. 3d se restó de esta imagen binaria para eliminar los pilares con su perímetro (Fig. 5e). Debido a los cambios en la iluminación durante el experimento, el contorno de algunos pilares permaneció y se requirieron pasos adicionales para eliminarlos de modo que no se tuvieran en cuenta en el volumen de CaCO3 precipitado (consulte el Material complementario). La fase de CaCO3 separada se muestra en la Fig. 5f.

Flujo de trabajo que presenta la extracción de la imagen binaria de cristales de la imagen de campo claro en t = 10 h (a) Sección de dimensiones 1,022 mm × 1,022 mm de la imagen sin procesar del canal verde; (b) Binarización de imágenes, (c) Función MATLAB "Imclose" para suavizar los bordes de los contornos de los cristales y cerrar cualquier agujero existente, (d) Función "rellenar" para rellenar los cristales y los pilares con blanco (e) Establecer el píxeles que corresponden a los pilares en la Fig. 3d en negro, (f) Resultado final de la segmentación del cristal (g) Resultado final del algoritmo de procesamiento de imágenes que segmenta el fluido de los poros (blanco), los granos sólidos (negro) y las bacterias (cian) en t = 10 h.

La imagen final procesada producida por el algoritmo presenta el espacio poroso en blanco (valor de píxel de 0), las bacterias en cian (valor de píxel de 1), el CaCO3 en rojo (valor de píxel de 2) y los pilares en negro (valor de píxel de 2). de 3) (Fig. 5g). Con el uso de este algoritmo, los pequeños cristales se pueden distinguir de las bacterias del mismo tamaño debido a la menor intensidad de su perímetro en el canal verde de la imagen de campo claro.

La cobertura de la superficie bacteriana se estimó calculando el área de los píxeles (con la función MATLAB "bwarea") con un valor de 1 en la imagen binaria de las bacterias (Fig. 4d). Con base en el tamaño informado de las células de Sporosarcina pasteurii de aproximadamente 0,9 a 1,2 μm de ancho por 2 a 3,5 μm de largo, y dado que las bacterias se multiplican por división celular23, para los siguientes cálculos asumimos que las dimensiones de una bacteria individual tienen 4 μm de largo por 1 μm de ancho. Para calcular la cantidad de bacterias, dividimos la cobertura de la superficie bacteriana por el tamaño promedio de una bacteria individual de 4 μm2. La concentración bacteriana se estimó dividiendo el número de bacterias por el volumen de poros de cada imagen, asumiendo un ancho de 1 μm en la tercera dimensión, debido a la forma de varilla de Sporosarcina pasteruii43. El volumen de poros se estimó restando el volumen de grano del volumen total de la posición muestreada. El volumen de grano en cada posición muestreada se obtuvo calculando el área de los píxeles con un valor de 1 en la imagen binaria de los pilares (Fig. 3d) y multiplicando por la profundidad del microfluido (50 μm).

Suponiendo una forma esférica de los cristales30,37, su diámetro equivalente D se definió como el promedio de sus ejes menor y mayor (simple o agregado); por lo tanto, su volumen equivalente es \(V_{cr,i} = \frac{4}{3}\pi \left( \frac{D}{2} \right)^{3}\). Se calculó la masa total de CaCO3 precipitado en cada posición muestreada:

donde ρ = 2,71 g/cm3 es la densidad de la calcita y n es el número de minerales detectados (que pueden ser tanto monocristales como agregados cristalinos).

La eficiencia de la reacción química E de MICP se define como la relación entre la masa de CaCO3 medida y el valor máximo teórico como si todo el calcio disponible localmente hubiera reaccionado, asumiendo que el calcio está distribuido uniformemente a lo largo del canal. Por lo tanto, la configuración adoptada permite arrojar luz sobre patrones de precipitación específicos y responder preguntas como: (i) ¿Se deposita preferentemente el CaCO3 en las proximidades de la entrada, donde el calcio está mayormente disponible? (ii) ¿la heterogeneidad de la red de poros afecta la deposición de CaCO3 a lo largo del camino reactivo?

La concentración de calcio en el CS inyectado es \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} M_{{{ \text{Ca}}^{2 + } }}\), donde \(c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 1\frac{{{\text{mol}}} }{L}\) es la concentración molar de calcio y \(M_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{ L}}}\) es la masa molar del calcio. Por lo tanto, \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{L}}}\).

Según la estequiometría de la ecuación química. (2), 1 mol de \({\text{Ca}}^{2 + }\) reacciona con 1 mol de \({\text{CO}}_{3}^{ - 2}\) para formar 1 mol de CaCO3. Por lo tanto, 40,08 g/mol de \({\text{Ca}}^{2 + }\) inyectado pueden formar teóricamente 100,09 g/mol CaCO3 si todo reacciona con carbonato antes de ser eliminado del chip de microfluidos.

La masa teórica del CaCO3 precipitado es:

donde \(M_{{{\text{CaCO}}_{3} }} = 100,09\;{\text{g/mol}}\) es la masa molar de CaCO3, \(Q\) es el caudal , y \({\Delta }t\) es el intervalo de tiempo desde el comienzo de la inyección de CS.

La eficiencia química local en cada posición se calculó de la siguiente manera:

donde \(m_{{{\text{CaCO}}_{3} ,{\text{t }}}}^{{({\text{s}})}}\) es la masa total estimada del CaCO3 precipitado en cada posición de muestra calculado por (3), \(PV_{l}\) es el volumen de poros en la posición específica, y \(PV_{TOT} = 74\;\upmu {\text{L}}\ ) es el volumen de poros total del canal de microfluidos. Cada posición corresponde aproximadamente al 0,3% de \(PV_{TOT}\). Al final de la inyección de CS, la masa teórica del CaCO3 precipitado es \(44,3\;{\text{mg}}\) en todo el chip, mientras que en cada posición muestreada es de 110 a 130 μg, dependiendo de la ubicación local. espacio poroso disponible.

Se cree que la densidad bacteriana afecta la tasa de crecimiento, el tamaño y la cantidad de precipitados de CaCO326. La Figura 6a presenta la concentración bacteriana a lo largo del chip promediada por triplicado al comienzo de la inyección de CS (t = 0) (Fig. 6a) y en t = 12 h (Fig. 6b). En t = 0, la concentración promedio de bacterias es más uniforme en el medio homogéneo que en el medio poroso heterogéneo a 0–800 mm, oscilando entre ~8 × 107 células/ml y 1,03 × 108 células/ml en el medio poroso heterogéneo , la concentración bacteriana disminuye de ~2 × 108 células/mL a 1 × 108 células/mL en los primeros 400 mm y presenta un pico a los 420 mm antes de caer a ~1–1,05 × 108 células/mL en el intervalo 600 –800 mm, donde permanece aproximadamente un 50% superior a la concentración en el medio poroso homogéneo. Cerca de la salida, se detectó una concentración bacteriana más baja de ~3 × 107 células/ml a 4 × 107 células/ml en los sistemas de microfluidos tanto homogéneos como heterogéneos.

(a) Concentración bacteriana de S. pasteurii al comienzo de la inyección de CS (t = 0); (b) en t = 12 h a través del camino reactivo de un metro de largo. Los puntos representan promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Durante la inyección de CS, las bacterias que no estaban adheridas a los pilares o al portaobjetos de vidrio fueron transportadas o encapsuladas en cristales de CaCO3 (Fig. 7). En t = 12 h, el medio poroso heterogéneo retuvo una concentración bacteriana promedio ligeramente mayor de ~3 × 107 células/mL a 7 × 107 células/mL que el medio homogéneo, donde se mantuvo una concentración promedio de ~2.5 × 107 células. /ml a 5 × 107 células/ml se observaron en 0–900 mm, mientras que cerca de la salida, la mayoría de las bacterias fueron eliminadas.

El crecimiento de monocristales y agregados de cristales en poros seleccionados del chip de microfluidos homogéneo capturó ~423 mm de la entrada.

En la Fig. 7 y la Fig. 8, respectivamente, se muestran imágenes del crecimiento de cristales en los poros seleccionados de los chips de microfluidos homogéneos y heterogéneos. La nucleación de los cristales comenzó 1 h después del inicio de la inyección de CS en medios porosos tanto homogéneos como heterogéneos. La Figura 7 muestra cristales individuales de CaCO3 formados 3 h después del comienzo de la inyección de CS a ~423 mm de la entrada. Los cristales se nuclearon tanto en los pilares como en el portaobjetos de vidrio, donde las bacterias permanecían adheridas. Inicialmente, todos los cristales presentaban un tamaño que no era lo suficientemente grande como para unir los granos sólidos adyacentes. En t = 4 h, se formaron cinco monocristales más (dos están desenfocados), mientras que los cristales existentes crecieron. Uno de los monocristales creció lo suficiente como para unir las dos partículas adyacentes. Otros dos cristales se fusionaron y formaron un agregado cristalino que también unió dos granos sólidos adyacentes. En t = 5 h, todos los cristales crecieron. Sin embargo, no se observó más crecimiento de cristales en esta posición seleccionada durante los siguientes períodos de 1 h y 40 min de inyección continua de CS o durante el período sin flujo hasta t = 18 h.

Evolución de la agregación cristalina en el espacio poroso entre tres granos sólidos cilíndricos de la réplica heterogénea de un medio poroso. Este poro se encuentra en un lugar muestreado a ~730 mm de la entrada.

La Figura 8 muestra cuatro pequeños cristales individuales de CaCO3 que se formaron 1 h después del inicio de la inyección de CS. Como en Wang et al.13, los puntos de nucleación únicos que están cerca uno del otro crecieron por separado hasta que se fusionaron para formar agregados cristalinos (mesocristales2). Aquí, la mayor parte del crecimiento se produjo dentro de las primeras 4 h, mientras que continuó a un ritmo muy lento hasta las 18 h. Esta tendencia también puede verificarse mediante los gráficos del crecimiento de la masa cristalina (Fig. 9). Esta figura presenta el crecimiento de la masa cristalina en dos posiciones: (a) cerca de la entrada y (b) en el medio del microfluido. Se puede observar que el crecimiento fue en general mayor en el medio poroso heterogéneo. En ambos medios porosos, la mayor parte del crecimiento se observó dentro de las primeras 4 h. Sin embargo, en el medio poroso heterogéneo, la tasa de crecimiento en las siguientes 9 h de tratamiento MICP fue mayor que la del medio poroso homogéneo que presentó una meseta. El crecimiento de los cristales se completó 5 h (t = 12 h) después del final de la inyección de CS de 6 h 40 min en la mayoría de los casos.

Crecimiento de la masa cristalina durante 12 h de tratamiento MICP en dos posiciones: (a) x = 30 mm y (b) x = 574 mm a lo largo del medio poroso homogéneo y heterogéneo. Los puntos representan promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación media absoluta.

La distribución del CaCO3 precipitado en la dirección transversal del flujo varía de una posición a otra, con cristales ocupando todo el plano o cerca de los límites (Fig. S5). Esto se puede atribuir a que la precipitación de CaCO3 altera la ruta del flujo o rutas preferenciales que llevan a los reactivos a zonas donde se mejora la mezcla. Sin embargo, los experimentos con tintes podrían proporcionar más información sobre el régimen de flujo en los dos chips y cómo afecta la mezcla de reactivos en el espacio poroso en evolución.

La eficiencia de la reacción química en el presente trabajo se define como el porcentaje de calcio inyectado que se convierte en CaCO3. La masa estimada del CaCO3 precipitado presenta un pico en el medio del canal de microfluidos para medios porosos tanto homogéneos como heterogéneos (Fig. 10a). La Figura 10b presenta la eficiencia estimada de la reacción química en medios porosos homogéneos y heterogéneos. Tanto los medios porosos homogéneos como los heterogéneos presentan una eficiencia de reacción no uniforme con respecto a la distancia. En el medio poroso homogéneo, la eficiencia es baja cerca de la entrada y alcanza un máximo a 420 mm con una media del 22%, mientras que se mantiene por debajo del 11% entre 600 y 990 mm. Por el contrario, el medio poroso heterogéneo presenta un valor máximo de eficiencia de reacción del 37% con una desviación estándar más alta en el medio del microfluido, y arroja valores entre 15 y 28% a distancias entre 500 y 900 mm de la entrada. Este hallazgo se acompaña además de una desviación menor para la red porosa heterogénea después de que se analizaron los triplicados. Postulamos que la discrepancia entre los valores de eficiencia medidos en el presente estudio y los reportados en la literatura para muestras a escala de laboratorio, típicamente superiores al 40%2, se debe a la mayor disponibilidad de superficies en experimentos de columnas 3D donde las características del grano, como la rugosidad44 o La angularidad de las partículas y las trayectorias de flujo tridimensionales más complejas favorecen la unión de las células y la precipitación de calcita.

(a) Masa final del CaCO3 precipitado; (b) eficiencia de reacción estimada al final del tratamiento MICP (t = 12 h) cuando se completó el crecimiento de los cristales. Los puntos representan los promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Con base en los hallazgos anteriores, una observación preliminar es que al usar extremos opuestos para la introducción de BS y CS, la biocementación aumenta en el medio del chip y posteriormente evoluciona hacia la ruta de flujo de CS. Sin embargo, la propia arquitectura de la red de flujo parece influir en esta evolución en términos de eficiencia de la reacción y propiedades cristalinas. Una posible explicación es que la tendencia predominante del CaCO3 en la red porosa homogénea es la de pequeños monocristales que no crecen lo suficiente como para obstruir las gargantas de los poros y eventualmente atraen más reactivos, lo que resulta en una menor eficiencia. Para la arquitectura porosa heterogénea, la tendencia es diferente, con varios puntos de nucleación que crecen en agregados más grandes (Fig. 11) y, por lo tanto, las gargantas de poros obstruidas crecen en tamaño e influyen dinámicamente en la tortuosidad de la red.

(a) Diámetro medio de los cristales. (b) Número final de cristales en t = 12 h. Los puntos representan los promedios de los triplicados; las áreas sombreadas representan la desviación absoluta media de los triplicados.

Estas tendencias distintivas se ilustran con más detalle en las figuras 11a, b, donde los números y tamaños de los cristales varían para los dos chips. Los cristales parecen ser más grandes en el medio heterogéneo (\(D_{eq}\) = 35–40 μm) que en el medio homogéneo (\(D_{eq}\) = 28–35 μm) entre 600 y 800 mm y produjo una desviación absoluta media mayor en la segunda mitad del chip (Fig. 11a). Además, se capturó una mayor cantidad de cristales (200–300 cristales) en la red porosa heterogénea entre 480 y 900 mm, lo que refleja una mayor masa y eficiencia de calcita en comparación con la red homogénea (con 60–100 cristales en el mismo intervalo). , con menor biocementación capturada durante los primeros 200 mm.

La permeabilidad de los canales de microfluidos se midió durante la inyección de CS. Reordenando la ley de Darcy para flujo incompresible en términos de la permeabilidad intrínseca k (m2), entonces:

donde \(Q\) es el caudal impuesto (m3/s), \(\mu\) es la viscosidad dinámica del agua (N∙s/m), L (m) es la longitud del canal de microfluidos, A ( m2) es el área de la sección transversal (HxW), \(p_{1}\) (N/m2) es la presión medida en la entrada y \(p_{2}\) (N/m2) es la presión medida en la salida.

La inyección de CS durante la cual se formaron y crecieron los cristales duró como se mencionó anteriormente durante 6 h y 40 min. La Figura 12 muestra la diferencia de presión medida entre la entrada y la salida durante la inyección de CS para la tercera réplica del experimento en el medio poroso homogéneo y heterogéneo. Los datos sin procesar se suavizaron con el uso del filtro Savitzky-Golay45 en Matlab, que es una técnica de ventana móvil que se basa en el ajuste polinómico de mínimos cuadrados locales en todo el dominio del tiempo. Los sensores de presión pudieron capturar el aumento en la diferencia de presión debido a la reducción de la porosidad por la nucleación y el crecimiento de los cristales, que alcanzó un estado casi estable 4 a 5 h después. Esto está de acuerdo con la tendencia observada con respecto al crecimiento de los cristales, tanto cualitativa (Fig. 7, 8) como cuantitativa (Fig. 9), de que la mayor parte del crecimiento de los cristales ocurre en las primeras 4 a 5 h de la inyección de CS. La Figura 12 muestra la evolución derivada de la permeabilidad intrínseca con el uso de la Ec. (6).

(a) Datos brutos y filtrados (con el filtro Savitzky-Golay45) de la evolución de la diferencia de presión. ( b ) Evolución de la permeabilidad intrínseca calculada durante la inyección de CS.

Después del final de la inyección de CS, se observó una reducción del 16% en la permeabilidad del medio poroso homogéneo, mientras que para el medio poroso heterogéneo, la reducción fue del 22%. La diferencia en la reducción de la permeabilidad entre los dos chips es sólo del 6%, lo que implica que la diferencia microscópica en el tamaño y número de cristales no afecta predominantemente a la permeabilidad macroscópica. La baja reducción de la permeabilidad muestra que hay suficientes vías de flujo alternativas que no están obstruidas. Los cambios generales en la permeabilidad se mantienen dentro del rango esperado de 1 orden de magnitud19. La precipitación de CaCO3 en gargantas de poros estrechos podría aumentar la resistencia mecánica y la rigidez25,46, en contraste con la precipitación en gargantas de poros abiertos que podrían reducir eficientemente la permeabilidad19,25.

Monitoreamos y visualizamos MICP en tiempo real dentro de chips homogéneos y heterogéneos. En este trabajo se presentó una nueva configuración experimental para la evaluación de los cambios de permeabilidad durante el tratamiento MICP y los cálculos de eficiencia. Se cuantificó el número de bacterias y la masa de precipitados en diferentes posiciones a lo largo de las trayectorias para expresar la distribución de la calcita y la eficiencia de la reacción y, en última instancia, determinar el efecto de las redes de poros en los patrones de precipitación. El trabajo introdujo un flujo de trabajo de procesamiento de imágenes basado en MATLAB para facilitar el manejo de una gran cantidad de datos producidos mediante la adquisición integral de imágenes. Las principales conclusiones de este trabajo incluyen las siguientes:

Con una inyección continua de 6 volúmenes de poros de CS, se formaron cristales de CaCO3 1 h después del inicio de la inyección de CS y se completaron 12 h después en ambos canales de microfluidos.

El crecimiento del cristal en términos de la masa producida de CaCO3 en diferentes posiciones a lo largo del chip es en general mayor en el medio poroso heterogéneo considerando que se aplicaron condiciones de tratamiento idénticas.

Al utilizar extremos opuestos para la introducción de BS y CS, en el medio poroso heterogéneo, la biocementación aumentó al 34% en la mitad del chip (420 mm) y posteriormente evolucionó hacia la ruta de flujo del CS con valores superiores al 20%, mientras que en el En medio poroso homogéneo, se alcanzó un pico del 27% 420 mm después del punto de inyección de CS, y la eficiencia de la reacción se mantuvo menos del 12% menor en el resto del medio microfluídico. Esto se atribuye a las tendencias observadas de una mayor cantidad de cristales que crecen en diámetro a pesar de la distribución bacteriana inicial casi idéntica para ambos medios. Esto implica que la evolución dinámica de la trayectoria del flujo reactivo es una fuente clave para comprender la evolución final del depósito de CaCO3 inducido por MICP.

Los hallazgos anteriores se capturan después de comparar triplicados donde las condiciones de tratamiento inicial (OD, parámetros de flujo, configuración de inyección) eran idénticas antes de la inyección en los chips homogéneos y heterogéneos. En el medio poroso homogéneo, la velocidad promedio es uniforme, lo que lleva a una distribución bacteriana uniforme. Por el contrario, en el medio poroso heterogéneo, que consta de zonas de mayor y menor velocidad, se acumulan más bacterias en la segunda mitad del chip, lo que posiblemente también ofrezca más sitios de nucleación disponibles para los cristales. Esto sugiere que las propiedades intrínsecas de los materiales porosos y la arquitectura de sus redes porosas influyen en el destino de la precipitación y los tortuosos caminos reactivos. Nuestro estudio arroja nueva luz sobre la evolución de MICP y su adaptación a la red de flujo disponible aprovechando los avances tecnológicos en microscopía, análisis de grandes datos y dispositivos de microfluidos, campos que se espera que crezcan dentro del área tradicional de la geomecánica.

La configuración experimental propuesta y el marco de análisis de imágenes se pueden ampliar al monitoreo en tiempo real de MICP a través de múltiples patrones de tratamiento utilizando diferentes recetas con el uso de microvolúmenes.

Los conjuntos de datos y el código utilizados para este estudio estarán disponibles tras su publicación bajo DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7319582.

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Este trabajo ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de subvención nº 788587). Los autores también desean agradecer al Laboratorio de Mecánica de Fluidos Ambientales de la Universidad de Lausana (Unil), al Dr. Stéphane Mahé por facilitar el cultivo bacteriano y al Dr. Mayumi Hamada por la microfabricación de los canales de microfluidos de un metro de largo.

Laboratorio de Mecánica de Suelos, EPFL, 1015, Lausana, Suiza

Ariadni Elmaloglou, Dimitrios Terzis y Lyesse Laloui

Laboratorio de Mecánica de Fluidos Ambientales, UNIL, 1015, Lausana, Suiza

Pietro De Anna

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AE llevó a cabo los experimentos de laboratorio. Los autores AE, DT y PdA contribuyeron al diseño, análisis e interpretación de los experimentos de laboratorio. LL y DT obtuvieron el apoyo financiero para el proyecto. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Dimitrios Terzis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Elmaloglou, A., Terzis, D., De Anna, P. et al. El estudio de microfluidos en un camino reactivo de un metro de largo revela cómo la heterogeneidad estructural del medio da forma a la biocementación inducida por MICP. Informe científico 12, 19553 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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Recibido: 14 de junio de 2022

Aceptado: 10 de noviembre de 2022

Publicado: 15 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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