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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10808 (2023) Citar este artículo

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El músculo distrófico se caracteriza por ciclos de necrosis/regeneración, inflamación y desarrollo fibroadipogénico. Las tinciones histológicas convencionales proporcionan datos topográficos esenciales de esta remodelación, pero pueden limitarse a discriminar contextos fisiopatológicos estrechamente relacionados. No mencionan los cambios de microarquitectura relacionados con la naturaleza y distribución espacial de los componentes del compartimento tisular. Investigamos si la autofluorescencia del tejido sin etiquetas revelada por la radiación ultravioleta profunda (DUV) del Sincrotrón podría servir como una herramienta adicional para monitorear la remodelación del músculo distrófico. Utilizando microscopía de campo amplio con filtros de fluorescencia de emisión específicos y microespectroscopia definida por alta resolución espectral, analizamos muestras de perros sanos y dos grupos de perros distróficos: animales ingenuos (gravemente afectados) y animales trasplantados de células MuStem (clínicamente estabilizados). El análisis estadístico multivariado y los enfoques de aprendizaje automático demostraron que la autofluorescencia emitida a 420-480 nm por el músculo bíceps femoral discrimina eficazmente entre muestras de perros sanos, distróficos y trasplantados. La microespectroscopia mostró que el músculo distrófico del perro muestra una autofluorescencia mayor y menor debido al entrecruzamiento del colágeno y al NADH, respectivamente, que el de los perros sanos y trasplantados, definiendo biomarcadores para evaluar el impacto del trasplante de células. Nuestros hallazgos demuestran que la radiación DUV es un método sensible y sin etiquetas para evaluar el estado histopatológico del músculo distrófico utilizando pequeñas cantidades de tejido, con aplicaciones potenciales en medicina regenerativa.

Las distrofias musculares (DM) son un grupo genéticamente heterogéneo de más de 50 enfermedades neuromusculares que afectan al músculo esquelético. Todos comparten debilidad y atrofia muscular progresiva, pero varían en la presentación clínica y la gravedad de los síntomas1,2. Se caracterizan por una degeneración local o generalizada de las fibras musculares1. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la DM más común y afecta a 1 de cada 3.500 a 5.500 recién nacidos varones3. Esta enfermedad muscular letal recesiva ligada al cromosoma X está causada por mutaciones en el gen de la distrofina, lo que provoca una falta de una proteína funcional esencial para mantener la integridad de las fibras musculares4. Esto da como resultado una profunda alteración de la homeostasis del tejido caracterizada por cambios en la composición de las fibras, mayor variación en el tamaño de las fibras, centronucleación, inflamación y reemplazo de las fibras musculares por tejidos fibrosos y adiposos5,6.

La caracterización histológica de los cambios extendidos en el músculo esquelético distrófico proporciona información importante sobre la fisiopatología de la enfermedad y es una herramienta clave utilizada para evaluar los efectos de nuevas estrategias terapéuticas7. Los parámetros tisulares cuantificables estándar, incluido el número de fibras, el diámetro de Feret, la composición del tipo de fibra, el porcentaje de fibras centronucleadas y la proporción de fibrosis y adiposis, se miden en secciones transversales de músculo esquelético teñidas utilizando técnicas de tinción topográfica clásica como la hematoxilina-eosina. -azafrán (HES), rojo Picrosirius y tricrómico de Gomori, y/o inmunomarcaje específico8. Sin embargo, la evaluación de la remodelación del tejido conectivo a veces puede ser más desafiante: la fibrosis endomisial puede ser difícil de cuantificar con precisión si el área de superficie ocupada se considera estrictamente sin integrar la disposición del colágeno dentro de la matriz extracelular, que se ha demostrado que es crítica en la función mecánica9. Por lo tanto, puede que no sea un criterio suficientemente discriminativo para una evaluación precisa de la progresión de la enfermedad. Del mismo modo, faltan métodos para evaluar la eficacia de las estrategias terapéuticas10. La evidencia reciente sugiere que la organización de la red de colágeno, y en particular el entrecruzamiento del colágeno, constituye un biomarcador potencial de DMD11,12,13. A nivel funcional, el entrecruzamiento del colágeno desempeña un papel fundamental en la rigidez muscular14,15 y se ha analizado mediante microscopía de luz polarizada12 e imágenes de segunda generación armónica (SHG)12 en secciones de tejido teñidas con Herovici13 y rojo Picrosirius. Recientemente demostramos que las imágenes SHG de tejido aclarado son un poderoso enfoque sin etiquetas para la caracterización 3D de la fibrosis cardíaca en la DMD16. Además, la autofluorescencia de biomacromoléculas en respuesta a la microscopía ultravioleta profunda (DUV) de Sincrotrón puede constituir un marcador útil para la caracterización ultraestructural de diferentes tejidos animales17,18,19 y para monitorear la tipificación de las fibras musculares y el estado metabólico20,21.

En el presente estudio, investigamos si el músculo distrófico tiene una firma tisular distintiva que puede detectarse sin tinción química y sin apuntar específicamente a un compartimento de tejido utilizando señales espectrales generadas con radiación fluorescente Synchrotron DUV. Se sometieron muestras de músculo esquelético de perros con distrofia muscular Golden Retriever (GRMD), un modelo animal clínicamente relevante de DMD22,23, a radiación Synchrotron DUV y se comparó la autofluorescencia resultante con la de perros Golden Retriever (GR) y GRMD sanos que se habían sometido a radiación adulta. Trasplante de células madre (células MuStem) (GRMDT), una terapia candidata para la DMD10,24,25,26,27. La autofluorescencia DUV generada por entrecruzamiento de colágeno, tirosina, elastina, triptófano y nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa (NADH) se puede identificar utilizando filtros de emisión selectiva de 300 a 540 nm con paso de banda estrecha (rango de 40 a 60 nm) y alta resolución espectral. (paso de 0,5 nm) utilizando microscopía DUV de campo amplio y microespectroscopia DUV, respectivamente18,19,20,21,28. Utilizando la anotación manual de imágenes, el análisis estadístico multivariado sin preprocesamiento de imágenes de sincrotrón y el aprendizaje automático, encontramos que los 3 grupos distintos de perros podían distinguirse en función de la intensidad diferencial de la emisión de autofluorescencia en el material muscular, que corresponde principalmente a diferencias en el colágeno cruzado. enlace, medido mediante microscopía DUV de campo amplio. Es importante destacar que aquí se aplicó el aprendizaje automático a partir de ejemplos etiquetados para encontrar patrones estructurales, adecuados para la clasificación automática, procesando datos de imágenes sin procesar por completo en lugar de elementos segmentados como bordes. Además, la microespectroscopia DUV reveló dos diferencias clave en la autofluorescencia en perros GRMD sin tratamiento previo versus controles GR sanos y perros GRMD tratados con células MuStem: un aumento significativo de la autofluorescencia en el rango 305-480 en el tejido conectivo endomisial debido a la reticulación del colágeno, y una disminución de la autofluorescencia alrededor de 460 nm dentro de las fibras musculares debido al NADH.

Nuestros hallazgos muestran por primera vez que el análisis de la radiación Synchrotron DUV permite caracterizar la remodelación del músculo distrófico con un alto poder de discriminación, utilizando sólo una pequeña cantidad de tejido no marcado. Revelan que esta técnica, aunque se aplica a una pequeña área de músculo que puede representar un límite en términos de representatividad y requerir equipos de microscopía específicos, podría ser útil para evaluar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas y ayudar en el seguimiento de los pacientes en el contexto de la medicina regenerativa.

Anteriormente demostramos que las inyecciones intraarteriales (IA) de células MuStem de tipo salvaje en perros GRMD jóvenes producen efectos beneficiosos sobre el estado clínico y la organización de los tejidos10,25. En el presente estudio, reproducimos estos efectos después de la administración de células intravenosas (IV), un enfoque quirúrgico que es mucho más aplicable en pacientes con DMD, en animales de 2,8 y 4,4 meses (Tabla 1). La discapacidad locomotora de los perros GRMD se cuantificó mediante una puntuación clínica compuesta basada en 17 parámetros individuales. A los perros GR sanos se les asignó una puntuación del 100%. En el momento de la inclusión en el protocolo, todos los perros GRMD tenían una puntuación clínica equivalente entre 89,1 y 93,9 %, excepto un perro (#6) con una puntuación de 79,8 % (Tabla 2). Al inicio del protocolo de trasplante, los perros GRMD tenían una puntuación clínica cercana entre 82,0 y 92,1%, excepto dos perros (#3 y #7) con una puntuación de 74,7% y 75,1%. Al final del protocolo (es decir, 4,9 a 6,4 meses después del primer trasplante de células), los perros GRMD mostraron deficiencias clínicas graves, caracterizadas principalmente por rigidez, postura anormal e incapacidad para correr o saltar en comparación con perros GR sanos de 8 a 10 meses. . Los 4 perros GRMD tuvieron puntuaciones variables que oscilaron entre el 23,3 y el 72,6%. A cambio, las puntuaciones obtenidas para los perros GRMDT fueron mucho más homogéneas, oscilando entre el 75,1 y el 87,0%. Se observó una diferencia significativa en la puntuación de discapacidad locomotora entre los perros GRMD y GRMDT (prueba de Mann-Whitney, p = 0,029). Además, se calculó la diferencia entre esta puntuación terminal y la puntuación clínica obtenida en la edad de inclusión para reflejar la progresión de la enfermedad en los dos grupos de perros distróficos. Durante este período, todos los perros GRMD mostraron un deterioro marcado o severo en sus puntuaciones clínicas (valor medio = -30,9%; rango: -51,8 a -19,53%), en contraste con los perros GRMDT para los cuales las puntuaciones clínicas fueron mucho más constantes. (valor medio = -4,1%; rango: -11,0 a + 1,4%). Estos resultados indican que la administración intravenosa de células MuStem alogénicas tiene un impacto clínico positivo, lo que resulta en la estabilización del estado clínico, de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores después del trasplante IA.

Para investigar los efectos histopatológicos de la administración intravenosa de células MuStem en músculo de perro GRMD, realizamos tinción topográfica estándar e inmunomarcaje contra la isoforma de desarrollo de la cadena pesada de miosina (MyHCd) en secciones transversales de perros GR, GRMD y GRMDT. La tinción con hematoxilina-eosina-azafrán (HES) mostró que el tamaño de las fibras musculares individuales de los perros GRMD y GRMDT era más heterogéneo en todas las secciones de músculo, en comparación con los GR sanos, un cambio llamado anisocitosis (Fig. 1; primera fila). Las secciones de músculos completos de perros GRMD y GRMDT mostraron algunas fibras necróticas aisladas, que en los perros GRMD a veces fueron reemplazadas por depósitos minerales. Si bien no se observaron fibras MyHCd+ en secciones de músculos de perros GR sanos, se detectaron algunas fibras positivas aisladas en secciones de perros GRMD (Fig. 1; segunda fila). Por el contrario, en las secciones de músculos de perros GRMDT observamos grupos de fibras MyHCd+ (flecha en la Fig. 1; segunda fila, panel derecho), lo que indica una regeneración muscular más sostenida. Además, en perros GRMD y GRMDT, también se detectaron grupos de células pequeñas (alrededor de 15 a 20 µm) con abundante citoplasma eosinófilo y núcleo grande como positivos para MyHCd y correspondían a mioblastos, lo que indica focos de regeneración de fibras (Figura S1, panel superior). . Secciones transversales enteras teñidas con rojo Picrosirius, que es específico para el colágeno, mostraron que el tejido perimisial y epimisial estaba engrosado por la fibrosis en perros GRMD versus GR (Fig. 1; tercera fila). No se observaron diferencias en el área positiva para colágeno en relación con el área total de la sección entre los perros GRMD y GRMDT (Figura S1, panel inferior). Finalmente, la histoenzimología para detectar la actividad de la nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa-tetrazolio reductasa (NADH-TR) en las mitocondrias mostró una distribución homogénea de fibras ricas y pobres en mitocondrias en perros GR sanos (Fig. 1; fila inferior). Esta distribución se vio notablemente alterada en perros GRMD y GRMDT, con alguna agrupación de tipos de fibras. No hubo diferencias entre los dos grupos de animales en términos de distribución mitocondrial.

Secciones histológicas seriadas representativas del músculo bíceps femoral de un perro. Las secciones transversales de perros sanos (Golden Retriever; GR), distróficos (Golden Retriever Muscular Dyscracy; GRMD) y perros GRMD distróficos tratados con células MuStem (GRMDT) se tiñeron con hematoxilina-eosina-azafrán (HES; primera fila, las puntas de flecha indican depósitos minerales en perros GRMD) e inmunomarcados para la isoforma de desarrollo de la cadena pesada de miosina (MyHCd; segunda fila, las flechas indican grupos de fibras positivas en el músculo del perro GRMDT). El tejido conectivo se visualizó mediante tinción específica con rojo Picrosirius (tercera fila). Las secciones se tiñeron histoenzimológicamente para visualizar la actividad de la nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa-tetrazolio reductasa (NADH-TR; fila inferior) en las mitocondrias. Se han utilizado las mismas etiquetas (flecha, punta de flecha) en las cuatro preparaciones histológicas (paneles superior e inferior) para resaltar las características de interés que se conservan después de la sección seriada de los tejidos. Barras de escala: 100 µm.

Para complementar estos datos, cuantificamos la cantidad de fibras recién formadas y el área de tejido conectivo en secciones de músculos completos de los tres grupos de perros según el etiquetado fluorescente para MyHCd y WGA, respectivamente (Fig. 2a). Detectamos 0,04% ± 0,20%, 8,63% ± 5,18% y 14,40% ± 7,78% de fibras MyHCd+ en perros GR, GRMD y GRMDT, respectivamente (Fig. 2b, arriba). Las muestras de músculo de perro GRMDT mostraron una mayor proporción de fibras MyHCd+ en comparación con las muestras de perro GRMD (p <0,001), lo que indica una mayor regeneración muscular después del trasplante intravenoso de células MuStem. El marcado con aglutinina de germen de trigo (WGA) de Alexa 555 mostró que el área ocupada por el tejido conectivo correspondía al 14,26% ± 5,20%, 32,05% ± 9,08% y 33,16% ± 3,74% en muestras de músculo esquelético de perros GR, GRMD y GRMDT. , respectivamente. En los perros GRMD, esta área fue mayor que la de los perros GR (p <0,001; Fig. 2b, abajo) y similar a la detectada en los perros GRMDT, lo que indica que el trasplante intravenoso de células MuStem no altera el grado de fibrosis endomisial en el músculo distrófico. En general, estos hallazgos demuestran que la actividad regenerativa del músculo distrófico es el principal marcador histopatológico del efecto de la administración intravenosa de células MuStem.

Análisis histomorfométrico del músculo bíceps femoral de un perro. (a) La actividad regenerativa se evaluó mediante inmunomarcaje para la isoforma de desarrollo de la cadena pesada de miosina (MyHCd, fila superior; rojo) en criosecciones musculares de células sanas (Golden Retriever; GR), distróficas (Golden Retriever Muscular DysTROphie; GRMD) y MuStem. -Perros distróficos GRMD (GRMDT) tratados. El tejido conectivo endomisial se tiñó con aglutinina de germen de trigo (WGA, fila inferior; magenta). Se realizó inmunomarcaje con laminina para delimitar el contorno de las fibras musculares. (b) El número de fibras MyHCd+ y la proporción de tejido teñido con WGA+ se determinaron en los 3 grupos. Barra de escala: 200 µm. La significación estadística se estimó mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey. **p<0,0001; * p = 0,0046.

Los marcados efectos de la administración intravenosa de células MuStem sobre el estado clínico general de los perros GRMD contrastan considerablemente con el modesto efecto observado a nivel histológico. Por lo tanto, exploramos la utilidad de otra modalidad de imagen para determinar si las propiedades de fluorescencia endógena del tejido en respuesta a la radiación DUV podrían servir como una firma del músculo enfermo. Aplicamos radiación DUV del sincrotrón a muestras de músculo esquelético de cada uno de los 3 grupos de perros. Específicamente, exploramos secciones de tejido sin etiquetas utilizando microscopía y microespectroscopia de campo amplio DUV, y realizamos análisis estadísticos de histogramas de fluorescencia para generar entradas para algoritmos de aprendizaje automático y metodologías de análisis de componentes principales, respectivamente (como se resume en la Fig. 3). Utilizando los valores originales de píxeles sin procesar, primero se calcularon estadísticas globales descriptivas en imágenes de los 3 grupos de perros (Fig. 3a) y los filtros correspondientes. Utilizando el conjunto de datos resultante, examinamos los 4 casos de clasificación que resultan de combinar pares de grupos de perros (GR vs GRMD, GR vs GRMDT, GRMD vs GRMDT) y los 3 grupos de perros juntos (GR vs GRMD vs GRMDT), para identificar inicialmente el el mejor conjunto de atributos y los mejores algoritmos de aprendizaje automático. A continuación, se aplicó el mejor conjunto de atributos a las versiones optimizadas de los mejores algoritmos de aprendizaje automático identificados (Fig. 3b). Este enfoque experimental se adapta bien a los objetivos de desarrollar un método no destructivo, de bajo consumo de tejido y sin etiquetas para el análisis de tejidos, utilizando análisis de fluorescencia sin sesgos.

Esquema esquemático del protocolo experimental y las técnicas analíticas utilizadas para obtener imágenes sin etiquetas de secciones de músculos utilizando radiación ultravioleta profunda de sincrotrón. (a) Investigación con microscopía de campo amplio (307–480 nm). Después de identificar las diferentes clases de fibras musculares (imágenes etiquetadas), se aplicaron 5 filtros para obtener 5 imágenes distintas de cada muestra, los parámetros estadísticos globales se calcularon utilizando los valores de píxeles sin procesar de esas imágenes (atributos de entrenamiento) y conjuntos de imágenes (conjuntos probados). de atributos) se utilizaron para evaluar 8 modelos de aprendizaje automático, probados con imágenes sin etiquetar para seleccionar el conjunto de atributos y algoritmos de aprendizaje automático más apropiado. (b) Las imágenes del filtro 4, identificado como la mejor fuente de atributos, se utilizaron para extraer parámetros estadísticos globales y locales para probar los dos mejores algoritmos de aprendizaje automático, Random Forest (RF) y Support Vector Machine (SVM). (c) Microespectroscopia (300–540 nm). Se utilizó un enfoque secuencial para medir alrededor de las fibras (paso 1) y dentro de las fibras (paso 2), y para producir los espectros correspondientes (paso 3), después de lo cual se realizó el análisis de componentes principales (paso 4).

Para evaluar la autofluorescencia en el tejido del músculo esquelético, se expusieron 3 muestras de cada uno de los 3 grupos de perros a la línea de luz de imágenes DISCO (excitación de 280 nm) para microscopía fluorescente de radiación Synchrotron DUV. Seleccionamos 5 filtros de emisión complementarios para investigar la autofluorescencia correspondiente al entrecruzamiento de tirosina, triptófano y colágeno. Para cada sección muscular se generó una serie de imágenes correspondientes a los diferentes patrones de mapeo de fluorescencia obtenidos con filtros complementarios (Fig. 4). En las imágenes generadas mediante la aplicación del mismo contraste, la intensidad de la fluorescencia se expresa utilizando una escala de colores que va del verde (baja intensidad) al naranja (alta intensidad) (icb azul naranja que se puede buscar en Fiji).

Radiación ultravioleta profunda sincrotrón para investigación con microscopía de campo amplio. (a) Ejemplos de imágenes originales en bruto adquiridas de perros sanos (Golden Retriever; GR), distróficos (Golden Retriever Muscular DysTROphie; GRMD) y perros GRMD distróficos tratados con células MuStem (GRMDT) utilizando 5 filtros de emisión distintos y diferentes intervalos de longitud de onda. (b) Histogramas agregados correspondientes (representados como una curva envolvente de los contenedores, en lugar del conjunto convencional de contenedores) para todos los filtros y grupos de perros. Barra de escala: 100 µm.

Como se muestra en la Fig. 4a, la baja relación señal-ruido y la presencia de contornos de fibras borrosos significaron que no siempre fue posible aislar perfectamente las fibras musculares del tejido conectivo mediante la segmentación de imágenes convencional. Por lo tanto, el análisis de imágenes se realizó sin aplicar suposiciones ni conocimientos previos sobre ninguna característica. A las imágenes se les aplicó la caracterización estadística de histogramas de nivel de gris de píxeles, dada su distribución unimodal y el hecho de que se pueden observar diferencias cuantitativas comparadas según el tipo de perro y filtro. Para los 3 grupos de perros, los histogramas (representados como una curva envolvente en lugar del conjunto convencional de contenedores) para los filtros 1, 2 y 3 mostraron una variación más amplia en los intervalos de nivel de gris y valores de nivel de gris más altos, y sus curvas se superpusieron a un gran extensión y es probable que genere información redundante (Fig. 4b). Los intervalos de nivel de gris en los histogramas de los filtros 4 y 5 tienen valores más bajos y recuentos más altos que los filtros 1, 2 y 3. Además, cuando los histogramas de los filtros se examinaron por separado para los 3 grupos de perros, los filtros 4 y 5 produjeron 2 conjuntos distintos de valores de fluorescencia bajos, con el doble de variación observada para el filtro 4 en relación con el filtro 5 (Fig. 5). Estas observaciones sugirieron que se podría extraer información diferenciadora de los histogramas de niveles de grises para estudiar los 4 casos de clasificación. Dados los elementos de morfología del histograma obtenidos, primero realizamos un análisis de imágenes utilizando un conjunto de 11 parámetros estadísticos globales (enumerados en la sección "Material y método"; Figura S2), probando 8 enfoques de clasificación supervisados ​​para determinar qué filtro proporcionó los mejores resultados. Estos enfoques de aprendizaje automático correspondieron al árbol de decisión, k-vecinos más cercanos, ensacado, impulso adaptativo, impulso de gradiente, votación, bosque aleatorio (RF) y máquina de vectores de soporte (SVM). Los parámetros estadísticos se calcularon sobre un total de 13.380 imágenes de 5 filtros, con 892 imágenes de cada tipo de filtro y para cada grupo de perros (es decir, cuando un filtro genera atributos, se emplean 1784 imágenes para clasificar 2 clases y 2676 para clasificar 3 clases). ). Los 4 casos de clasificación se probaron aplicando por separado los 8 algoritmos de clasificación supervisados ​​adaptados a datos pequeños y a nuestro conjunto de atributos (Fig. 3a). Los conjuntos de datos se equilibraron y los algoritmos de clasificación se ejecutaron inicialmente con parámetros predeterminados, sin optimización. Los enfoques supervisados ​​con la mejor precisión de clasificación en comparación con los otros 6 algoritmos de clasificación fueron RF y SVM, respectivamente (Fig. 6a y b). RF utiliza una combinación de muestreo aleatorio, aleatoriedad de características y aprendizaje de conjuntos para analizar datos. Se construye un conjunto de árboles de decisión independientes sobre un subconjunto aleatorio de datos de entrenamiento (para aumentar la diversidad y reducir el sobreajuste) y características (para evitar que las características dominantes dominen el modelo). Luego se construyen árboles de decisión dividiendo los datos de forma recursiva optimizando la homogeneidad de los subconjuntos resultantes. Una clasificación resulta de la agregación de resultados de árboles individuales, es decir, se selecciona la clase más común predicha por los árboles. SVM se define en un espacio de características de alta dimensión de datos separables linealmente o no linealmente, donde cada punto de datos está representado por un vector de valores de características. Se define un hiperplano que separa los datos de interés en diferentes clases. Se caracteriza por un margen que representa la distancia máxima entre el hiperplano y los puntos de datos más cercanos de cada clase. Los vectores de soporte son los puntos de datos que se encuentran más cerca del límite de decisión. El modelo entrenado predice la clase de nuevos puntos de datos evaluando en qué lado del límite de decisión se encuentran.

Información complementaria Representación de la radiación ultravioleta profunda de Sincrotrón según filtros. Histogramas agregados de los cinco filtros (representados como una curva envolvente de los contenedores, en lugar del conjunto de contenedores convencionales), que combinan los grupos de células sanas (Golden Retriever; GR), distróficas (Golden Retriever Muscular DysTROphie; GRMD) y MuStem. perros GRMD distróficos tratados (GRMDT) para cada filtro.

Rendimiento de clasificación (precisión) para Random Forest y Support Vector Machine. La entrada para Random Forest (RF; a) y Support Vector Machine (SVM; b) consistió en parámetros estadísticos globales extraídos de imágenes generadas usando cada uno de los 5 filtros para cada uno de los 3 grupos de perros (sano [Golden Retriever; GR], distrófico [Distrofia muscular del Golden Retriever; GRMD] y perros GRMD distróficos tratados con células MuStem [GRMDT]) y los extraídos de los 5 filtros combinados. (c) Datos de clasificación de rendimiento obtenidos para los enfoques RF y SVM utilizando como entradas la combinación de parámetros estadísticos locales globales y complementarios calculados solo para imágenes capturadas usando el filtro 4 de las 3 clases de perros. En ambos casos (parámetros predeterminados y optimizados), se aplicó una validación cruzada de k veces usando k = 10. Las barras que representan la desviación estándar se muestran solo para las condiciones optimizadas de RF y SVM, ya que en todos los demás casos estos valores fueron muy pequeños ( < 0,01%).

El algoritmo RF mostró la mayor precisión para el caso GR vs GRMD (81,23%), seguido de GR vs GRMDT (80,27%), GRMD vs GRMDT (74,40%) y GR vs GRMD vs GRMDT (69,10%). El algoritmo SVM mostró la mayor precisión para GR vs GRMDT (82,43%), seguido de GR vs GRMD (82,35%), GRMD vs GRMDT (74,63%) y GR vs GRMD vs GRMDT (70,42%). Los valores obtenidos con SVM fueron ligeramente superiores a los obtenidos con RF. La clasificación de las 25 combinaciones posibles de 2, 3, 4 y 5 filtros mostró que el filtro 4 superó a todas las demás opciones. La comparación de los 4 casos de clasificación reveló que los perros GR vs GRMD y los perros GR vs GRMDT probablemente eran las clases más contrastadas independientemente del tipo de filtro: dependiendo del enfoque de clasificación utilizado, los mejores resultados siempre correspondieron a uno u otro de estos casos. Los resultados de precisión más bajos se obtuvieron para el caso GR vs GRMD vs GMDT, independientemente del algoritmo de clasificación utilizado. Se observó un rendimiento de clasificación intermedio para el caso GRMD vs GRMDT. A continuación, los algoritmos de clasificación RF y SVM se optimizaron y ejecutaron para los mismos 4 casos de clasificación utilizando los parámetros estadísticos locales globales y complementarios obtenidos de las imágenes generadas con el filtro 4. Cada algoritmo de clasificación se optimizó escaneando automáticamente intervalos de valores para identificar los valores específicos. de parámetros seleccionados que dieron como resultado el mejor rendimiento. Todas las combinaciones posibles fueron evaluadas en la cuadrícula de evaluación resultante. Para RF, los parámetros evaluados seleccionados fueron número de árboles, profundidad máxima y criterio. Para SVM los parámetros evaluados fueron ν (regularización), ϵ (tolerancia a errores), γ (curvatura del límite de decisión) y C (penalización por clasificación errónea), utilizando un tipo SVM de clasificación de vectores de soporte C (C-SVC) y un núcleo de función de base radial (RBF). En comparación con los algoritmos ejecutados con parámetros predeterminados, la optimización dio como resultado mejoras en el rendimiento de la clasificación del 9,30% ± 2,13% al 15,19% ± 2,52%, lo que se traduce en un aumento considerable de la precisión (Fig. 6c). Esto confirmó la validez de aplicar RF o SVM a la combinación de parámetros estadísticos locales globales y complementarios para las imágenes generadas por el filtro 4. Se observaron mejoras en el rendimiento para los 4 casos de clasificación, de la siguiente manera: GRMD vs GRMDT (15,19% ± 1,80%) y GR vs GRMD vs GRMDT (15,19% ± 2,52%) para RF, seguido de GR vs GRMD vs GRMDT (13,98% ± 2,37%) y GRMD vs GRMDT (11,51% ± 1,79%) para SVM. También se observaron mejoras en el rendimiento de clasificación (entre 9,30 y 10,43%) para GR vs GRMD y GR vs GRMDT (92,11%) con SVM, y GR vs GRMD (90,53%) y GR vs GRMDT (90,70%) con RF. SVM superó a RF en los 4 casos cuando se aplicaron los parámetros predeterminados. Sin embargo, SVM tuvo un rendimiento ligeramente mejor que RF en 2 casos (GR frente a GRMD y GR frente a GRMDT) cuando se aplicó la optimización. Cuando se optimizaron, ambos algoritmos funcionaron de manera comparable en el caso de GR, GRMD y GRMDT. Estos hallazgos establecen que el análisis de microscopía DUV de campo amplio con baja resolución espectral (60 nm) puede discriminar eficientemente muestras de músculo de perro GR, GRMD y GRMDT basándose en la autofluorescencia emitida a 420 nm y 480 nm.

Basándonos en los alentadores resultados obtenidos con la microscopía DUV de campo amplio, buscamos refinar la firma espectral del músculo de los 3 grupos de perros mediante el uso de microespectroscopia DUV Synchrotron. Aunque requiere mucho más tiempo, este enfoque permite un nivel de resolución espectral 40 veces mayor que el obtenido en la microscopía de campo amplio con escaneo separado de fibras musculares y tejido conectivo, gracias a la función de escaneo por punto realizada en la imagen obtenida en microscopía de campo claro. Utilizamos esta técnica para analizar el tejido conectivo y el citoplasma de las fibras musculares con una resolución espectral de 0,5 nm (Fig. 7a). Los datos espectrales DUV se adquirieron en el rango de 300 a 540 nm en muestras de músculo de 3 perros sanos GR (azul), 3 GRMD (rojo) y 3 GRMDT (verde). Los espectros fueron preprocesados ​​y sometidos a análisis de datos multivariados (The Unscrambler® X, CAMO Software Process AS). Se realizó un Análisis de Componentes Principales (PCA) y los resultados se representaron en un gráfico de puntuación en el que cada punto corresponde a un único espectro registrado (Fig. 7b). En el tejido conectivo (arriba), se pueden distinguir 3 grupos a lo largo del eje PC-1 (64%) en el gráfico de puntuación. Mientras que las manchas azules (GR) formaron un grupo homogéneo sobre el eje horizontal, las manchas rojas (GRMD) formaron una gran agrupación heterogénea a lo largo del eje vertical negativo. Curiosamente, un grupo de puntos verdes (GRMDT) se fusionó con el grupo azul (GR), mientras que un segundo grupo de puntos verdes ubicado debajo del eje horizontal estaba claramente separado de los puntos rojos (GRMD). El gráfico de puntuación obtenido para el citoplasma de las fibras musculares reveló una separación más pronunciada de los grupos de perros distróficos. Se observaron tres grupos claramente distintos correspondientes a los diferentes grupos de perros a lo largo del eje PC-1 (67%). Las manchas verdes (GRMDT) estaban en gran medida separadas de las manchas rojas (GRMD) y mostraron un alto nivel de superposición con las manchas azules (GR). Luego examinamos el gráfico de carga, en el que se investigó la contribución de cada número de onda al agrupamiento de los espectros desde la posición positiva o negativa con respecto al eje x del gráfico de carga (Fig. 7c). Para mediciones en tejido conectivo, demostramos que la banda de entrecruzamiento de colágeno como la pentosidina (355–480 nm) estaba en la parte negativa del gráfico de carga (debajo del eje x), lo que indica una mayor intensidad de fluorescencia para GRMD (puntos rojos) que GR. (puntos azules) perros en un rango de emisión que se sabe que es una firma de entrecruzamiento del colágeno19. Curiosamente, este también fue el caso en la comparación con los perros GRMDT (puntos verdes), excepto por un animal (ID#2; grupo rodeado). Además, la banda característica de NADH (540–480 nm) estaba en la porción positiva de la curva de carga (sobre el eje x), lo que indica una menor intensidad de fluorescencia de NADH para los perros GRMD (puntos rojos) en comparación con los perros GR. Excepto por un animal, los perros GRMDT mostraron una mayor intensidad de fluorescencia de NADH que los perros GRMD. Para las mediciones tomadas dentro de las fibras, la banda de emisión característica de NADH se ubicó en la porción positiva de la curva (sobre el eje x), lo que indica una intensidad de fluorescencia comparable en perros GRMDT (puntos verdes) y GR (puntos azules), los cuales fueron más altos que el de los perros GRMD (puntos rojos). La característica espectral observada a 460 nm en el gráfico de carga respalda aún más la opinión de que la autofluorescencia de NADH puede discriminar eficazmente las muestras de músculo de perro GRMD de las de perros GR y GRMDT. En general, estos hallazgos indican que los datos de la microespectroscopia DUV se pueden utilizar para distinguir los perros GRMD de los otros 2 grupos en función de una menor intensidad de fluorescencia de NADH (540–480, 460 nm) dentro de las fibras musculares y una mayor intensidad de fluorescencia asociada al entrecruzamiento del colágeno (480 –355 nm) en el tejido conectivo. Es importante destacar que mostramos por primera vez una separación clara entre los grupos de perros GRMDT y GRMD, con un primer grupo que abarca puntos de datos de tejido conectivo para 2 de 3 perros GRMDT y 3 perros GR y un segundo grupo que abarca puntos de datos de fibra de citoplasma para todos los GRMDT y Perros GR. Estos hallazgos subrayan aún más el impacto beneficioso del trasplante de células MuStem en el fenotipo muscular de los perros GRMD.

Investigación del citoplasma del tejido conectivo y de las fibras musculares con microespectroscopia de radiación ultravioleta profunda Sincrotrón. (a) Se obtuvieron datos espectrales de ultravioleta profundo (DUV) entre 300 y 540 nm para tejido conectivo (arriba) y citoplasma de fibras (abajo) en el músculo esquelético de 3 animales por grupo de perros: sano [Golden Retriever; GR], distrófica [Distrofia muscular del Golden Retriever; GRMD] y GRMD distrófico tratado con células MuStem [GRMDT]. (b) Los datos se analizaron mediante Análisis de Componentes Principales (PCA), se preprocesaron (normalización de vectores unitarios) y se sometieron a análisis de datos multivariados (The Unscrambler® X; CAMO Software Process AS). Los resultados, obtenidos para perros sanos GR (azul), GRMD (rojo) y GRMDT (verde), se representaron mediante un gráfico de puntuación en el que cada punto corresponde a un único espectro. En el tejido conectivo (arriba), se separaron 3 grupos en los gráficos de puntuación: (i) a lo largo del eje PC-1, separación de perros GRMD (rojo; ubicado en la parte negativa de PC-1) de perros GR sanos (azul) y parte de los perros GRMDT (verde), ambos ubicados en el lado positivo del eje PC-1; (ii) a lo largo del eje PC-2, perros GRMD (rojo) y parte de perros GRMDT (verde; rodeados) que formaban un grupo a la derecha del eje PC-2. Se distribuyeron perros GR sanos (azul) y parte de perros GRMDT (verde) desde ambos lados del eje PC-2. En el citoplasma de la fibra muscular (abajo), se separaron 2 grupos: (i) a lo largo del eje PC-1, separación de perros GRMD (rojo; ubicado en la parte negativa de PC-1) de perros GR sanos (azul) y un GRMDT perro (verde), ambos fusionados y ubicados en el lado positivo del eje PC-1; (ii) a lo largo del eje PC-2, los perros GRMD (rojo) formaron un grupo a la derecha del eje PC-2, mientras que la mayoría de los perros GR sanos (azul) y los perros GRMDT (verde) se distribuyeron a ambos lados del eje PC-2. (c) También se generaron gráficas de carga, donde se investigó la contribución de cada número de onda en la agrupación de los espectros. Los gráficos de carga correspondientes revelaron las principales bandas de emisión características de entrecruzamiento de colágeno (arriba) y NADH (abajo).

En este estudio, proporcionamos datos originales y convincentes que demuestran el poder de la radiación DUV para discriminar el tejido del músculo esquelético dañado, destacando su potencial para caracterizar la remodelación del tejido distrófico. Nuestros datos indican que un análisis estadístico de histogramas de intensidad de fluorescencia endógena recopilados en diferentes longitudes de onda a partir de mediciones de campo amplio DUV es un enfoque imparcial válido para procesar la totalidad de la señal generada por la sección de tejido. De hecho, este enfoque, realizado por primera vez en un conjunto de datos de Sincrotrón, nos permitió distinguir el músculo esquelético de perros GRMD sin tratamiento previo del de perros GRMD que se habían sometido a un trasplante de células madre adultas, en contraste con los resultados obtenidos utilizando técnicas histológicas cuantitativas convencionales. Además, el poder discriminatorio de los datos de campo amplio DUV se confirmó mediante microespectroscopia DUV, que se caracteriza por un alto nivel de resolución espectral, lo que valida el enfoque experimental. Utilizamos imágenes de radiación DUV para distinguir con alto nivel de precisión por primera vez los siguientes grupos: GR vs GRMDT, GRMD vs GRMDT y GR vs GRMD vs GRMDT, además de los grupos de perros GR vs GRMD ya bien clasificados. A pesar de las dificultades para determinar correctamente la forma de las fibras mediante la segmentación de imágenes y, por lo tanto, la imposibilidad de clasificar las fibras según sus características geométricas, estos resultados sugieren que los parámetros estadísticos globales y locales combinados proporcionan atributos adecuados para el aprendizaje automático supervisado. A nivel biológico, demostramos que el trasplante de células MuStem en un modelo animal de distrofia puede conducir a una organización de la red de colágeno más similar a la observada en animales sanos. En conjunto, estos hallazgos describen una nueva modalidad de examen microscópico de muestras de músculo distrófico que requiere muy poco tejido, no tiene etiquetas y es altamente sensible, lo que permite un análisis más profundo de la remodelación del tejido. Además, los resultados proporcionan evidencia adicional de la capacidad de las células MuStem para remodelar favorablemente el músculo distrófico a largo plazo después de la administración sistémica, con un impacto observado aquí en particular en el tejido conectivo 5 meses después de la administración. Esto refuerza la idea de una acción pleiotrópica de estas células madre adultas, como se evoca en nuestros estudios previos que involucran enfoques ómicos imparciales25,26. En general, nuestros hallazgos consolidan aún más el trasplante de células MuStem como una terapia candidata prometedora para la DMD.

Un atributo clave de la microscopía/microespectroscopia de radiación DUV es la ausencia de etiquetado con sondas externas (es decir, colorantes y anticuerpos), que pueden ser fuentes de artefactos experimentales y/o específicos de cada especie. Esto confiere a la técnica un carácter universal que se presta mejor a la comparación de estudios realizados en diferentes laboratorios. Un segundo beneficio clave de la técnica es que requiere una pequeña cantidad de material tisular, lo que suele ser un elemento limitante, especialmente cuando se trabaja con muestras humanas. La desventaja de explorar un área restringida de músculo es que puede no ser representativa del estado del tejido, ya sea en estudios preclínicos o ensayos clínicos, y es necesario tener en cuenta la idea de explotar varias áreas en paralelo para garantizar que los datos producido es un fiel reflejo del estado general del tejido.

Utilizando microscopía de campo amplio DUV y microespectroscopia, demostramos que el análisis de la fluorescencia endógena emitida por el tejido conectivo puede distinguir los músculos del perro GR, GRMD y GRMDT con un alto nivel de precisión. Esto es particularmente interesante dado que la fibrosis endomisial es una de las principales características histopatológicas en la evolución de la DMD29,30,31. El área ocupada por tejido conectivo en secciones transversales de músculo distrófico, previamente teñidas con rojo Picrosirius, WGA o inmunomarcadas para colágeno I32,33,34, se cuantifica de forma rutinaria para adquirir información sobre la progresión de la enfermedad y/o evaluar el impacto de genes o células. estrategias de terapia en estudios preclínicos10,35,36. Nuestros hallazgos, generados a partir de un enfoque basado en radiación DUV realizado por primera vez en músculo de perro distrófico, consolidan los resultados anteriores que revelan que la organización de la red de colágeno es, así como el área de fibrosis, un criterio importante a considerar al estudiar el Remodelación del músculo distrófico. Curiosamente, el análisis de la radiación DUV dirigida a la estructura del tejido conectivo permitió distinguir entre el músculo GRMDT y el GRMD, mientras que no se encontraron diferencias significativas cuando se consideró el área del tejido endomisial mediante enfoques histopatológicos convencionales. Esto sugiere una mayor sensibilidad del enfoque DUV. Estos datos originales se obtuvieron aquí en el músculo Bíceps femoral, por lo que sería informativo definir si se encuentran resultados idénticos en otros músculos distróficos que puedan presentar un fenotipo de lesión diferente, para poder informar el grado de discriminación de la medición. También vale la pena señalar que se ha informado que los cambios cualitativos en el tejido fibroso (es decir, el grado de entrecruzamiento del colágeno) desempeñan un papel funcional importante en el músculo distrófico14,15, lo que resalta aún más la relevancia de los datos de radiación DUV presentados aquí. Por ejemplo, la organización arquitectónica de la red de colágeno es un factor clave que contribuye a la rigidez muscular en pacientes con DMD, así como en los modelos de ratón mdx y perro GRMD11,12. Un estudio reciente que utilizó microscopía de luz polarizada o microscopía de segunda generación armónica no informó una correlación clara entre el nivel de alineación de las fibras de colágeno y el criterio de elasticidad muscular12. Con base en los datos espectrales diferenciales obtenidos para perros GRMD y GRMDT, sería interesante realizar una exploración funcional y un análisis de radiación DUV utilizando los mismos músculos aislados para investigar la asociación entre las modificaciones del tejido conectivo causadas por el trasplante de células MuStem y la rigidez y elasticidad muscular. Utilizando microespectroscopia DUV para realizar mediciones espectrales de alta resolución en tejido conectivo, obtuvimos espectros para 2 de los 3 perros GRMDT similares a los obtenidos en muestras de perros GR, lo que puede sugerir una respuesta variable al trasplante de células. Sin embargo, cabe señalar que las mediciones se realizaron en un solo tipo de músculo, el músculo bíceps femoral, y no hubo correlación con los resultados obtenidos para los demás criterios evaluados, es decir, puntuación clínica y actividad de regeneración. De acuerdo con varios estudios que informaron variabilidad fenotípica en perros GRMD25,37, este resultado también podría reflejar una intensidad de lesión más pronunciada en 1 de los perros GRMD incluidos en el estudio.

Además del entrecruzamiento del colágeno, el triptófano, la tirosina y el NADH se encuentran entre las moléculas autofluorescentes más abundantes observadas en los músculos expuestos a la radiación DUV19,38. Otro hallazgo clave de nuestro estudio es que los datos espectrales correspondientes al NADH en el citoplasma de las fibras musculares distinguen claramente el GRMDT del músculo del perro GRMD, pero también los agrupan con los del perro GR, lo que sugiere un retorno al valor normal para este parámetro después del protocolo de administración celular. Estos resultados indican que la intensidad de la autofluorescencia DUV asociada con NADH dentro de las fibras musculares podría constituir un segundo biomarcador del impacto beneficioso del trasplante de células MuStem.

Las mediciones de microespectroscopia DUV realizadas a nivel del tejido conectivo y el citoplasma de la fibra muscular indican un aumento significativo en la autofluorescencia asociada al entrecruzamiento del colágeno y una disminución significativa concomitante en la intensidad de la autofluorescencia de NADH en el músculo de perros GRMD versus GR. Estas observaciones son consistentes con los hallazgos de varios estudios que muestran que la modificación del entrecruzamiento del colágeno11,39 y la disfunción mitocondrial40,41 están asociadas con la DMD. Recientemente demostramos una desorganización significativa de la red de colágeno en el músculo cardíaco de ratas distróficas, como lo demuestran la poliorientación, compactación y acortamiento de las fibras16. En el presente estudio, informamos cambios en el entrecruzamiento del colágeno y en el NADH, que proviene predominantemente de las mitocondrias donde sirve para la síntesis de ATP, en el músculo GRMD después de la administración sistémica de células MuStem, con características espectrales correspondientes similares a las obtenidas en Músculo del perro GR. Estos resultados concuerdan con nuestros estudios ómicos anteriores sobre las consecuencias del trasplante de células MuStem, que revelan un impacto en múltiples procesos biológicos, incluida la integridad estructural de los haces de músculos a través de la acción a nivel de la arquitectura de las fibras, la organización de la matriz extracelular y el metabolismo energético25. 26. Más de 6 meses después de la administración intraarterial de células MuStem en perros GRMD, la proteómica cuantitativa de las necropsias del músculo bíceps femoral ha revelado cambios significativos en el contenido de colágeno I y en el enriquecimiento de los términos de ontología genética, incluido el proceso de reducción oxidativa y el proceso metabólico de ATP. y mitocondria, en comparación con los datos obtenidos en el perro GRMD sin tratamiento previo26. Curiosamente, se han identificado diferentes subunidades de NADH deshidrogenasa como proteínas significativamente subrepresentadas después del trasplante de células.

Nuestro estudio demuestra que la microscopía/microespectroscopia de radiación DUV representa una herramienta poderosa para la exploración sin etiquetas de secciones musculares para estudios preclínicos. No obstante, ciertas mejoras para optimizar la adquisición de Synchrotron DUV podrían ayudar a aumentar aún más su poder discriminatorio. La adquisición de imágenes utilizando longitudes de onda de excitación óptimas duales podría permitir una investigación más específica del entrecruzamiento del colágeno y el NADH. Además, un paso de banda de filtro de emisión más específico permitiría una mayor separación de la emisión de fluorescencia y, por tanto, una mejor discriminación entre los músculos de los perros GR, GRMD y GRMDT. Dado el tamaño del conjunto de datos utilizado en el presente estudio, aplicamos aprendizaje automático supervisado con ingeniería de características. Sin embargo, nuestros resultados indican que es posible mejorar el rendimiento de la clasificación. Una alternativa a los modelos de clasificación optimizados sería definir, automáticamente y sin supervisión, las características apropiadas de la imagen de radiación DUV mediante el aprendizaje de representación utilizando un enfoque de aprendizaje profundo como los codificadores automáticos. Esto requeriría estudios que utilicen un modelo animal de DMD que permita un tamaño de muestra mayor que el que se puede lograr con perros GRMD, como la rata DMDmdx, que se utiliza cada vez más en estudios preclínicos35,42, para aumentar el tamaño de la imagen. conjunto de datos relacionados.

Describimos el uso de radiación DUV combinada con microscopía de campo amplio y microespectroscopia para realizar el primer análisis imparcial de fluorescencia endógena en músculo distrófico. Nuestros hallazgos muestran que la radiación sincrotrón DUV utilizada en microscopía de campo amplio y microespectroscopia representa una herramienta sensible que complementa los enfoques de histomorfometría clásica y facilita la caracterización del músculo distrófico y la evaluación eficiente de estrategias terapéuticas basadas en células.

En este estudio se incluyeron un total de 12 perros Golden Retriever (GR) machos de 2,5 meses de edad. Todos los perros se obtuvieron del Centre d'Elevage du Domaine des Souches (CEDS, Mezilles, Francia) o del Centro Boisbonne de terapia genética y celular (Oniris, Nantes, Francia). Los perros fueron alojados en el Centro de Boisbonne en un ambiente controlado (temperatura 21 ± 1 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h). Los perros con distrofia muscular Golden Retriever (GRMD) se identificaron al nacer mediante genotipado basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describió anteriormente43. Se crearon tres grupos (N = 4 animales por grupo) para estudios clínicos y/o fisiopatológicos (Tabla 1): perros GRMD tratados con células MuStem e inmunosupresores (IS) (GRMDT; #1 a #4); perros GRMD que reciben IS únicamente (GRMD; #5 a #8); y perros sanos (GR; #9 a #12). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Consejo Nacional de Investigación de Francia. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética en Experimentación Animal de la Región Pays de la Loire, Francia (Número de permiso: CEEA.2012.104). Además, el estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia inducida con ketamina (Imalgene 1000, Merial, Toulouse, Francia)/diazepam (Valium, Roche, Boulogne-Billancourt, Francia) y que se mantuvo mediante una mezcla inhalatoria de isoflurano (Vetflurano, Virbac, Magny-en). -Vexin, Francia) y oxígeno. Para minimizar el sufrimiento se realizó tratamiento analgésico con ácido tolfenámico (4 mg/kg, Tolfedine, Vetoquinol SA, Magny Vernois, Francia). El dolor se evaluó diariamente como parte de una evaluación clínica completa realizada por un veterinario y se proporcionó analgesia si se consideraba necesario. Los perros fueron sacrificados mediante administración intravenosa de pentobarbital sódico (2000 mg; Dolethal, Vetoquinol SA, Magny Vernois).

Se aislaron células MuStem de tipo salvaje, correspondientes a células madre de adherencia retardada, de los músculos de las extremidades traseras de perros sanos de 10 semanas de edad, como se describió anteriormente10. Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 y se pasaron cada 4 a 5 días cuando alcanzaron aproximadamente el 75 % de confluencia. El medio de crecimiento se reemplazó cada 2 días.

La inmunosupresión de perros GRMD y GRMDT se logró mediante la administración diaria de 27 mg/kg de CsA oral (Neoral®; Novartis, Rueil-Malmaison, Francia) en combinación con 6 mg/kg de micofenolato mofetilo (CellCept®; Roche, París, Francia). . También se añadió diariamente ketoconazol (10 mg/kg; Nizoral®; Janseen-Cilag, Issy-les-Moulineaux, Francia) para disminuir el catabolismo de la CsA. Los niveles sanguíneos de CsA se controlaron dos veces por semana y se mantuvieron entre 250 y 350 ng/ml mediante ajustes de dosis individuales. El régimen inmunosupresor se inició 1 semana antes de la administración de células MuStem y se mantuvo durante todo el estudio.

Se utilizaron células MuStem en el paso 5 (P5) o 6 (P6), que corresponde a células que han experimentado entre 22 y 27 duplicaciones de población acumuladas. Se prepararon suspensiones celulares con un rango de densidad de 12 a 18 × 106 células/ml en NaCl al 0,9 %/suero homólogo al 2,5 %/heparina 10 UI/ml. Se realizaron tres inyecciones de 5,5 a 8,0 × 107 células/kg en las venas cefálicas a intervalos de 10 a 12 días en perros GRMD inmunodeprimidos (GRMDT; #1 a #4) a partir de las 11,0 a 18,2 semanas de edad (Tabla 1). utilizando flujo laminar a una velocidad de 12 a 15 ml/min, como se describió anteriormente10.

Los perros fueron evaluados clínicamente por un veterinario de forma no ciega semanalmente durante todo el protocolo experimental, utilizando una versión modificada de la cuadrícula descrita anteriormente10,43. Brevemente, se estableció una puntuación clínica basada en 11 criterios de locomoción y músculos y 6 ítems relacionados con el estado de salud general. La puntuación se expresó como el porcentaje de la puntuación máxima del 100% para todos los perros sanos.

Se recogieron quirúrgicamente pequeños trozos (0,5 cm3) de necropsias del músculo bíceps femoral de la porción media del músculo en perros de 36,0 a 47,4 semanas de edad, excepto en un perro que fue sacrificado a las 33,6 semanas por razones éticas y utilizado para estudios histológicos. análisis. Este momento corresponde a 5,0 a 6,7 ​​meses después del inicio del protocolo de trasplante de células. Las muestras de músculo se congelaron rápidamente en isopentano (VWR internacional, Fontenay-sous-Bois, Francia), se enfriaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento. Se colocaron secciones de criostato transversales en serie de 8 μm de espesor en portaobjetos de vidrio para tinción histológica e inmunomarcaje de fluorescencia y análisis posterior con escáner de portaobjetos (Axioscan Zeiss, Jena, Alemania). Además, se colocaron secciones de criostato transversales en serie de 10 μm de espesor en portaobjetos de cuarzo para microscopía ultravioleta profunda (DUV) y microespectroscopia DUV (línea de haz Synchrotron DISCO, Soleil, Francia).

Sectas musculares en serie. (8 μm) se tiñeron con hematoxilina-eosina-azafrán (HES), rojo Picrosirius y nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa-tetrazolio reductasa (NADH-TR) para proporcionar información sobre la organización del haz de músculos, el contenido del tejido conectivo y la distribución mitocondrial. Para estudiar específicamente la fibrosis endomisial, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con aglutinina de germen de trigo conjugada con Alexa-Fluor 555 (WGA; 1:500, W32464; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) después de la permeabilización con Triton X-0,1 %. 100 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin-Fallavier, Francia) e incubación con tampón de bloqueo (mezcla de 5% de suero de cabra y 5% de albúmina sérica bovina en solución salina tamponada con fosfato [PBS] 0,1 M, Sigma-Aldrich). Para evaluar la actividad regenerativa del músculo, las secciones se permeabilizaron y saturaron como se describe anteriormente, luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo dirigido contra la isoforma de desarrollo de la cadena pesada de miosina (MyHCd; 1:100, NCL-MHCd; Novocastra) y Alexa-Fluor. IgG anti-ratón de cabra conjugada con 555 (1:300, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Para la cuantificación de las fibras MyHCd+, se consideraron 5 regiones de interés, cada una de las cuales comprende de 100 a 300 fibras, en una sección histológica completa de cada uno de los 4 perros por grupo, para analizar un conjunto de 500 a 1500 fibras por perro. Los cortes histológicos fueron leídos y analizados por un patólogo veterinario certificado por el comité del consejo europeo de la especialidad.

Las imágenes, correspondientes a la sección completa de cada muestra de tejido, se adquirieron utilizando un escáner de portaobjetos (AxioScan.Z1, Zeiss, Jena, Alemania) con modos de imagen de fluorescencia y campo claro (objetivo Plan Apocromático 10X). Las imágenes de campo claro se realizaron con iluminación LED y detección de cámara Tri-CDD Hitachi. Las imágenes de fluorescencia se realizaron con iluminación XCITE LED FIRE, emisión de paso de banda (EM BP 445/50 (DAPI), EM BP (525/50 [Alexa-Fluor 488] y EM BP 605/70 [Alexa-Fluor 555]). La histomorfometría se realizó con el software Fiji, se midió la superficie correspondiente al marcaje fluorescente WGA en el endomisio, se cuantificó la proporción de fibras MyHCd+ en secciones musculares de los 4 perros de cada grupo, considerando al menos 500 fibras por grupo, y se realizaron análisis estadísticos. realizado con GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.).

La obtención de imágenes de fluorescencia UV sincrotrón se realizó en la línea de luz DISCO en las instalaciones de radiación sincrotrón SOLEIL (Saint-Aubin, Francia)44. La línea de luz del sincrotrón DISCO tiene una estación de imágenes experimental en la que el imán flexible emite radiación DUV en el visible, continuamente sintonizable de 180 a 600 nm (1,2 a 10 eV). Muchos grupos aromáticos y enzimas se iluminan naturalmente bajo excitación UV sin marcadores externos. Esto hace que la línea de luz DISCO sea muy adecuada para el estudio in situ de muestras biomédicas, mediante el análisis de la fluorescencia intrínseca de las moléculas45,46.

Secciones cruzadas del músculo bíceps femoral congelado. (10 µm) de perros 4 GR, 4 GRMD y 4 GRMDT. Las secciones se colocaron en portaobjetos de cuarzo para obtener imágenes DUV. El sistema de imágenes DUV de campo amplio Synchrotron está construido alrededor de un microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) con óptica de cuarzo únicamente. El haz blanco de la línea de luz DISCO en el Sincrotrón SOLEIL es monocromatizado por un iHR320 (Jobin-Yvon Horiba) antes de acoplarse con la entrada del Zeiss Axio Observer Z1 modificado. El haz monocromático se fijó a 280 nm. Un espejo dicroico nítido que transmite solo por encima de 300 nm (Omega Optical) reflejó la luz incidente antes de la focalización en la muestra a través de un Zeiss Ultrafluar 40X (NA 0,6, inmersión en glicerina). La emisión se registró con una cámara Pixis 1024-BUV (Princeton Instruments) después de pasar por una serie de filtros de paso de banda (307–323 nm, 327–353 nm, 370–410 nm, 420–480 nm y 435–455 nm; Semrock, IDEX Salud y Ciencia, LLC). Estos canales se eligieron en función de los grupos aromáticos que fluorescen en estas longitudes de onda, en base a los cuales se puede asociar la presencia de diferentes aminoácidos, proteínas o entrecruzamientos de colágeno. Así, el primer canal fue asimilado a la presencia de tirosina, el segundo y tercero a la presencia de triptófano y finalmente los dos últimos al entrecruzamiento de colágeno19. Las imágenes de fluorescencia generalmente se registraron con tiempos de exposición de 1 a 5 s. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 40X (0,276 µm/píxeles). Para fines de unión, se ha seleccionado una región de interés centrada (404 × 424 píxeles correspondientes a 111 µm × 117 µm) de la cámara. Por lo tanto, no se observaron artefactos de costura ni sombreado, lo que permitió la generación de imágenes grandes que comprenden 36 imágenes más pequeñas (350 × 350 píxeles) (ejemplo: 2424 × 2544 píxeles = 666 µm × 702 µm). Se adquirieron ciento cuarenta y cuatro imágenes por muestra. Se realizaron ilustraciones de adquisiciones de microscopía de campo amplio DUV utilizando el software Fiji47.

Se aplicaron algoritmos de aprendizaje automático porque, para identificar las 3 clases de interés, las características complejas y variables relevantes de las imágenes de autofluorescencia son muy difíciles de definir manualmente o aplicando algoritmos de segmentación, mientras que pueden capturarse de manera más eficiente mediante enfoques de aprendizaje. Teniendo en cuenta que los valores de los parámetros estadísticos de cada imagen solo representan una clase de perro (independientemente del tipo de filtro), los patrones en las imágenes DUV se evaluaron entrenando modelos de clasificación supervisados ​​adaptados a escenarios de datos pequeños, utilizando ejemplos etiquetados de cada una de las 3 clases para analizar. 4 problemas de clasificación: GR vs GRMD, GR vs GRMDT, GRMD vs GRMDT y GR vs GRMD vs GRMDT. Se utilizaron parámetros estadísticos globales calculados para los histogramas de todos los filtros para cada una de las 3 clases para abordar los 4 problemas de clasificación, y se probaron 8 enfoques de clasificación supervisados: árbol de decisión, k-vecinos más cercanos, embolsado, impulso adaptativo, impulso de gradiente, votación. , máquina de vectores de soporte (SVM) y bosque aleatorio (RF) (Fig. 3a). Según los resultados, identificamos el filtro con el mejor rendimiento de clasificación, así como los enfoques de clasificación correspondientes. Luego se calcularon parámetros estadísticos locales complementarios a partir de los histogramas del filtro con el mejor rendimiento de clasificación y se combinaron con los respectivos parámetros estadísticos globales (Figura S2), para ser utilizados como entradas en los enfoques de clasificación de mejor rendimiento. Los algoritmos de aprendizaje automático se desarrollaron con el lenguaje de programación Python y algunas bibliotecas como OpenCV (visión por computadora abierta), NumPy (programación numérica), Pandas (análisis de datos), scikit-learn (aprendizaje automático), PIL (manipulación de imágenes) y matplotlib ( visualización).

Las secciones de tejido se colocaron sin medio de montaje específico en portaobjetos circulares de cuarzo para imágenes DUV (diámetro 12,7 mm, espesor 0,17 mm, óptica ESCO, Nueva Jersey, EE. UU.). Se utilizó un haz monocromático a 280 nm a través de un objetivo 40X (Ultrafluar, Zeiss, Alemania) y la recuperación de la fluorescencia se realizó entre 300 y 540 nm con resolución espectral de 0,5 nm. El espectro se eligió hasta 530 nm para explorar la banda característica del NADH19. Se realizó una exploración de un solo punto para analizar por separado la fibra y el tejido conectivo. Se adquirieron un total de 230 espectros por región (citoplasma de fibras y tejido conectivo) y por animal, utilizando 3 perros por grupo (GR, GRMD, GRMDT). Los datos espectrales se analizaron utilizando el conjunto de datos multivariados The Unscrambler® X (CAMO Software Process AS). Los espectros se agruparon en una misma matriz. Se crearon matrices de trabajo reuniendo muestras de los mismos grupos de perros. Se preprocesaron seiscientos noventa espectros por grupo de perros de acuerdo con el método de normalización de vectores unitarios para poder comparar cada espectro uno por uno y realizar un Análisis de Componentes Principales (PCA) en la varianza entre espectros. Si bien los gráficos de puntuación permitieron la comparación de los espectros DUV, los gráficos de carga correspondientes revelaron las principales bandas de emisión características detrás de la agrupación de los espectros.

Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Los datos se analizaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Se consideró significativo un valor de p ≤ 0,05. Los parámetros estadísticos globales y locales para la clasificación de imágenes se calcularon con el lenguaje de programación Python y la biblioteca scipy.stats (funciones estadísticas).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al personal del Centro Boisbonne (Oniris Nantes, Francia) y a la plataforma APEX (Centro de Excelencia Nikon Nantes, denominado IBISA y Biogenouest) en INRAE/Oniris PAnTher UMR 0703 (Oniris, Nantes, Francia) por su notable participación en la investigación animal. atención y soporte técnico, respectivamente. Los autores también agradecen a Biogenouest (red central de instalaciones de ciencias biológicas y medio ambiente del oeste de Francia, respaldada por el “Conseil Régional des Pays de la Loire”) y a NeurATRIS (Infraestructura de investigación traslacional para bioterapias y neurociencias) por su continuo apoyo a la plataforma APEX. . Los autores agradecen al personal del Sincrotrón SOLEIL por su ayuda con el uso de la línea de luz DISCO (propuesta 20170283).

ND fue financiado por una beca Master 2 otorgada por Oniris e IMT Atlantic (Francia). RF y JP fueron financiados por “La Région Pays de la Loire” a través de Biogenouest. Este trabajo fue apoyado por una subvención del “Fonds Européen de Développement Régional” (FEDER; No. PL0003686). Se realizó en el contexto del proyecto IHU‐CESTI que recibió apoyo financiero del gobierno francés gestionado por la ANR (Agence Nationale de la Recherche) a través de la inversión del futuro programa ANR‐10‐IBHU‐005. El proyecto IHU‐CESTI también recibió el apoyo de subvenciones de “La Région Pays de la Loire” y “Nantes Métropole”. Synchrotron SOLEIL contribuyó proporcionando acceso a las instalaciones de radiación de Synchrotron.

Estos autores contribuyeron igualmente: Laurence Dubreil, John Puentes y Karl Rouger.

Oniris, INRAE, PAnTher, 44300, Nantes, Francia

Laurence Dubreil, Noreddine Damane, Romain Fleurisson, Marine Charrier, Julien Pichon, Isabelle Leroux, Cindy Schleder, Mireille Ledevin, Thibaut Larcher y Karl Rouger

IMT Atlantique, Lab-STICC, UMR CNRS 6285, 29238, Brest, Francia

Noreddine Damane y John Bridges

Sincrotrón SOLEIL, BP48, L'Orme Des Merisiers, 91120, Gif-Sur-Yvette, Francia

Frederic Jammé

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LD y KR diseñaron el estudio. ND y JP realizaron análisis de imágenes de experimentos de microscopía DUV de campo amplio. LD, RF, M.Ch., FJ, KR realizaron la adquisición de datos en la línea de haz DISCO. JP llevó a cabo análisis de imágenes de inmunofluorescencia. IL y CS aislaron los lotes de células MuStem y prepararon las suspensiones celulares para el trasplante. LD y FJ realizaron análisis de imágenes de experimentos de microespectroscopia DUV. ML realizó muestreo de tejido e inmunohistoquímica. TL realizó un seguimiento clínico de los perros, sacrificó a los animales, participó en el proceso de muestreo de tejido y aportó su experiencia en histopatología. KR y TL realizaron el protocolo in vivo. LD, JP y KR recopilaron y/o ensamblaron los datos, participaron en el análisis y la interpretación de los datos. LD, JP y KR escribieron el manuscrito y son los garantes de este estudio. LD, JP y KR tienen acceso completo a todos los datos del estudio y asumen la responsabilidad de la integridad de los datos. FJ revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Laurence Dubreil o Karl Rouger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Dubreil, L., Damane, N., Fleurisson, R. et al. Firma endógena específica y sin etiquetas del músculo distrófico mediante radiación ultravioleta profunda de sincrotrón. Representante científico 13, 10808 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37762-1

Descargar cita

Recibido: 03 de abril de 2023

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 04 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37762-1

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