Nuevos conocimientos sobre las respuestas metabólicas inducidas por la ingestión de defensinas vegetales en la plaga del insecto polífago Helicoverpa armigera

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3151 (2023) Citar este artículo

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La plaga del insecto lepidóptero Helicoverpa armigera es una de las plagas más destructivas de las plantas de cultivo y se están desarrollando varios enfoques biotecnológicos para su control. Las defensinas vegetales son pequeños péptidos catiónicos y ricos en cisteína que desempeñan un papel en la defensa de las plantas. La ingestión de una defensina de Capsicum annuum (CanDef-20) indujo una reducción dependiente de la dosis en la masa de larvas y pupas, retrasó la metamorfosis y también redujo gravemente la fecundidad y la fertilidad en H. armigera. Para comprender los mecanismos moleculares de la antibiosis mediada por la ingestión de CanDef-20 en larvas de H. armigera, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparativo. La regulación negativa predominante de los GO representa endopeptidasas de tipo serina, constituyentes estructurales de los ribosomas y componentes integrales de la membrana y la regulación positiva diferencial de la unión de ATP, el núcleo y la traducción, mientras que se detectó una regulación positiva de la unión de ácidos nucleicos representada por elementos transponibles. Se encontró que diferentes isoformas de lipasa, serina endopeptidasa, glutatión S-transferasa, cadherina, fosfatasa alcalina y aminopeptidasas estaban reguladas positivamente como una respuesta compensatoria a la ingestión de CanDef-20. Los ensayos enzimáticos in vitro y el análisis qPCR de algunos genes representativos asociados con procesos celulares vitales como la metamorfosis, la digestión de los alimentos y la membrana intestinal indicaron regulaciones diferenciales adaptativas en larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20. Concluimos que la ingestión de CanDef-20 afecta el metabolismo de los insectos de varias maneras a través de su interacción con la membrana celular, enzimas, proteínas citoplasmáticas y la activación de la movilización de transposones que están relacionados con el retraso del crecimiento y las estrategias adaptativas en H. armigera.

Las plagas de insectos provocan pérdidas sustanciales de rendimiento en las plantas de cultivo, ya sea por daños directos o por la propagación de enfermedades. De la cantidad de insectos plaga que amenazan y atacan a las plantas de cultivo, Helicoverpa armigera es la polífaga y la más devastadora1. Se han utilizado en todo el mundo medidas de control como el uso de diversos pesticidas y enfoques basados ​​en cultivos transgénicos, aunque H. armigera desarrolla resistencia2, lo que lleva al fracaso de estos métodos, lo que requiere el desarrollo de nuevos enfoques biológicos para el control de plagas sostenible y respetuoso con el medio ambiente.

Los insectos polífagos han desarrollado múltiples mecanismos de resistencia como la producción de glutatión S-transferasa, glucosa oxidasa, sobreexpresión de proteasa insensible y citocromo P450 monooxigenasa para hacer frente a las defensas de las plantas3. Los mecanismos moleculares de resistencia de los transgénicos Bt se han estudiado en los últimos años. La mutación en la cadherina y el gen transportador ABCC2 presente en el epitelio del borde en cepillo de H. armigera y H. virescens resultó en la resistencia contra la toxina Bt4. Además de esto, la expresión alterada de la fosfatasa alcalina (ALP)5, la aminopeptidasa N (APN)6 y los eventos regulatorios en la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)7 fueron los mecanismos de resistencia utilizados por los insectos lepidópteros contra la toxina Bt. Estos estudios proporcionan evidencia de una notable diversidad y plasticidad en el metabolismo de los insectos para contrarrestar las defensas de las plantas.

Las plantas han desarrollado sofisticadas redes reguladoras para presentar respuestas de defensa constitutivas e inducidas contra los ataques de herbívoros3. La inducción de las vías de jasmonato (JA) y ácido salicílico (SA)4 seguidas de la producción de metabolitos secundarios, inhibidores de proteinasas (PI)5 y péptidos antimicrobianos (AMP) determinan una respuesta de defensa de la planta específica de plagas. El efecto de los AMP sobre los insectos no está claramente descifrado y se sabe que existe una probabilidad mucho menor de generar resistencia a los AMP en las bacterias que a los antibióticos8. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de contradefensa del insecto contra las moléculas de defensa de las plantas, como los péptidos de defensina, nos ayudará a piramidar las moléculas de defensa para un mejor control de plagas de insectos9.

Los AMP como las defensinas fueron menos explorados en el contexto de las interacciones planta-insecto H. armigera, aunque su papel como péptidos antifúngicos y antibacterianos está bien estudiado a través de sus interacciones con las membranas celulares10, las proteínas citoplasmáticas11 y los canales transmembrana12. Las defensinas vegetales son péptidos catiónicos con ~ 45–50 aminoácidos con una estructura tridimensional conservada que representa el pliegue αβ (CSαβ) estabilizado con cisteína, de cuatro a cinco enlaces disulfuro y el motivo del núcleo γ13, el principal determinante que confiere actividad antifúngica y antibacteriana 14. Algunos estudios confirman la actividad de unión directa a la membrana celular del motivo del núcleo γ15,16. En nuestro trabajo anterior, hemos discutido el potencial inhibidor del crecimiento de Capsicum annuum defensina (CanDef-20) en H. armigera17. CanDef-20 causó alrededor de un 15% de retraso en la masa larvaria y una reducción del 12% en la masa de pupas, aunque los mecanismos a través de los cuales CanDef-20 induce implicaciones fisiológicas y morfológicas en la plaga de insectos aún no están claros. El presente estudio intenta descifrar el mecanismo de acción de CanDef-20 en H. armigera mediante un enfoque transcriptómico.

En este estudio, nuestro objetivo fue (i) comprender los efectos dependientes de la dosis de la ingestión de CanDef-20 en H. armigera (ii) dilucidar las respuestas fisiológicas y moleculares de H. armigera alimentada con CanDef-20 recombinante utilizando un enfoque transcriptómico comparativo de novo y (iii) comprender las correlaciones en los niveles de expresión génica con la actividad proteica/enzimática y las respuestas adaptativas de H. armigera hacia la ingestión de la defensina vegetal CanDef-20. Comprender el papel y el mecanismo de acción de las defensinas de las plantas en las plagas de insectos será un paso adelante en el diseño de medidas sostenibles de control de plagas para la agricultura.

Los tejidos florales de C. annuum (variedad local Phule Jyoti) se utilizaron para la amplificación y clonación del gen CanDef-20 como se describió anteriormente17. Las semillas de C. annuum se adquirieron en el mercado local y se cultivaron en una policasa. Los experimentos de biología molecular como la amplificación del gen defensina, la clonación de genes y la expresión recombinante de proteínas se realizaron después de la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC-SPPU) según las directrices del Departamento de Biotecnología del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Gobierno de la India http://dbtbiosafety.nic.in/ o Directrices y manual.

Los huevos de H. armigera se obtuvieron de la Oficina Nacional de Recursos Agrícolas Importantes (NBAIR), Bangalore. Se permitió que los huevos eclosionaran y los recién nacidos fueron transferidos con una dieta artificial como se describió anteriormente17. Para los bioensayos con CanDef-20 sólo se utilizaron insectos de una generación criados en el laboratorio.

La expresión de la proteína CanDef-20 recombinante y el ensayo de transferencia puntual se realizaron como se describió anteriormente17. Para la expresión de proteínas, se utilizó la cepa de Pichia pastoris con construcciones genéticas (CanDef-20) o el vector vacío (EV) en el vector alfa pPICZ en medio complejo de metanol tamponado (BMMY) (base de nitrógeno de levadura 10 × y tamponado con fosfato de potasio 1 M). tampón pH 6,0) (Hi-media, India). Las proteínas recombinantes se obtuvieron del sobrenadante del cultivo después de precipitación con sulfato de amonio al 90% y diálisis. Las muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 15% (p/v)18. Las proteínas recombinantes expresadas utilizando este sistema portaban una etiqueta C-terminal 6X His y myc.

El CanDef-20 recombinante se confirmó mediante un ensayo de transferencia puntual utilizando anticuerpo primario anti-myc de conejo (Abcam, EE. UU.) dirigido contra la etiqueta c-myc del CanDef-20 expresado de forma recombinante. Se utilizó anticuerpo secundario anti-conejo del kit Western Blot Development (Bangalore genie, India). Finalmente, las manchas se desarrollaron incubando la membrana en solución BCIP/NBT.

El bioensayo larvario de H. armigera se realizó utilizando recién nacidos del segundo día mantenidos con una dieta artificial (AD). El DA utilizado en el ensayo de alimentación estuvo compuesto por componentes mayoritarios y menores que contienen ácido ascórbico, ácido sórbico, extracto de levadura, colesterol, vitaminas, hidroxibenzoato de metilo y harina de garbanzo que se mezclan con agar-agar hervido en agua para formar un alimento semisólido19 . Un total de 25 recién nacidos fueron liberados individualmente en AD incorporado con 15,5 y 31,25 μg/ml de CanDef-20 recombinante y se consideró como conjunto-1 en un recipiente pequeño separado con un diámetro de 3 cm. El conjunto 2 con 50 recién nacidos se realizó en paralelo y consta de 62,25, 125, 250 μg/ml de CanDef-20 recombinante. Las proteínas expresadas por AD (control) y EV P. pastoris (control EV) se procesaron individualmente para los conjuntos respectivos. La masa larval, el desarrollo, la mortalidad, la masa de las pupas, la fecundidad y la fertilidad se registraron hasta por 22 días durante el bioensayo. Todos los conjuntos de bioensayo se mantuvieron a 30 °C con 70% ± 10% de humedad con un fotoperiodo de 16 h. Periódicamente se registró la masa larvaria y pupal. Las pupas formadas se separaron en vasos de precipitados y se controlaron para detectar la aparición de polillas. Las polillas fueron alimentadas con una solución de azúcar al 10% y se les permitió aparearse en 8:4 y 12:6 (proporción hembra:macho) para los conjuntos 1 y 2 respectivamente en una jaula (30 × 20 × 15 cm) con una tela de malla desmontable. en la tapa para la recogida de huevos. Se registró el número de huevos y de neonatos eclosionados.

Se utilizaron muestras de insectos (alimentadas con 125 μg/ml de CanDef-20 recombinante y AD incorporado con control EV) para el aislamiento de ARN utilizando el kit de preparación de muestras de ARN TruSeq v2 según el protocolo del fabricante. Las bibliotecas se generaron utilizando el kit TruSeq DNA PCR-Free siguiendo las recomendaciones del fabricante. La secuenciación se realizó utilizando Illumina HiSeq. 2000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) con estrategia de lecturas de pares. El binario BCL (llamadas base) se convierte a FASTQ mediante el paquete Illumina bcl2fastq (v1.8.4).

Las lecturas sin procesar se verificaron utilizando la herramienta Fastqc20 y la herramienta Cutadapt21 para eliminar adaptadores y secuencias de baja calidad. Además, se descubrió que los archivos de secuencia tienen una puntuación Phred promedio por base > 30. Las lecturas normalizadas se ensamblaron en fragmentos más largos (contigs) utilizando el software Trinity v2.0.622. Se buscaron transcripciones ensambladas para detectar transcripciones codificantes utilizando la herramienta transdecodificadora23. En estas transcripciones ensambladas se buscaron más a fondo el hallazgo de orf utilizando el programa transdecodificador y la integridad de la transcripción. Se buscaron anotaciones adicionales en todas las secuencias codificantes de proteínas utilizando la base de datos de proteínas uniprot de insectos con un límite de valor e <1e-10. Algunos genes no caracterizados expresados ​​diferencialmente se identificaron adicionalmente mediante el análisis Uniprot id y BLAST. Para una evaluación adicional de la integridad del ensamblaje y la anotación, se realizó el análisis BUSCO (Benchmarking Universal Single Copy Orthologs, versión 5.4.3) comparándolo con el linaje de artrópodos en la configuración predeterminada (http://busco.ezlab.org/).

Para comparar los perfiles de expresión génica entre H. armigera alimentado con CanDef-20 y EV control, se asignaron lecturas limpias de cada biblioteca al ensamblaje utilizando el software RSEM24 y se realizó una estimación de abundancia en el paquete Trinity. Los niveles de expresión de las transcripciones se calcularon según el método de normalización de FPKM utilizando el paquete edgeR25. La identificación de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se llevó a cabo utilizando bibliotecas de control EV como referencia. Los valores de FPKM de los genes detectados tanto en el control alimentado con CanDef-20 (tratado) como en el control EV se utilizaron para derivar la relación (tratado/control), a la que se aplicó una escala log 2 para obtener valores de cambio. Las transcripciones con log2FC ≥ ± 2 con valor de P ≤ 0,05 y FDR ≤ 0,05 se filtraron como los DEG estadísticamente más significativos. Para obtener más DEG y genes expresados ​​de forma única a partir de larvas alimentadas con CanDef-20, también se identificaron transcripciones con proporciones log2FC ≥ + 0,8 y ≤ − 0,8. Las transcripciones con log2FC ≥ + 0,8 se consideraron reguladas al alza en larvas alimentadas con CanDef-20, mientras que las transcripciones con valores de cambio de veces (≤ − 0,8) se consideraron reguladas a la baja. Finalmente, se realizó un análisis de enriquecimiento de GO para conjuntos de DEG utilizando el método manual y el software FUNC26.

Para la extracción de ARN, se utilizaron larvas enteras pulverizadas en nitrógeno líquido (50 mg) de CanDef-20 que ingirieron el cuarto estadio (125 y 250 μg/ml alimentadas con larvas de H. armigera), control EV y alimentación AD. Se trataba de muestras de insectos diferentes de las utilizadas para la secuenciación, pero tratadas en condiciones experimentales similares. El ADNc se sintetizó a partir de 1000 ng de ARN utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc verso (Thermofisher, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron utilizando NCBI Primer (Tabla complementaria S3) y se validaron mediante el análisis de sus eficiencias de amplificación por PCR (E) y coeficientes de correlación (R2), antes del análisis en tiempo real. La mezcla de reacción consta de 1 µl de plantilla de ADNc diluida 0,5 veces, 5 µl de 2 × Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Lituania), 1 µl de cada cebador específico de gen y ddH2O para completar el volumen. . Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 50 °C por 2 min, 95 °C por 2 min, 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 60 °C por 30 s; con curva de fusión de 5 s a 95 °C, 65–95 °C, aumento de 0,5 °C/ciclo. Se utilizó el método 2-ΔΔCt para detectar cambios relativos en la PCR cuantitativa en tiempo real y se utilizó el gen de actina de H. armigera para normalizar los datos.

Las larvas de H. armigera alimentadas con AD y AD incorporadas con 125 μg/ml de proteínas CanDef-20 y EV respectivamente se utilizaron para la detección de las actividades enzimáticas totales de amilasa, proteasa, lipasa, glutatión S-transferasa (GST), aminopeptidasa y fosfatasa alcalina. enzimas. Brevemente, se homogeneizaron 50 mg de larvas enteras pulverizadas en nitrógeno líquido en 200 μl de tampón de glicina-NaOH 0,2 M, pH 10,0 y se mantuvieron a 4 ° C durante 2 h. La suspensión se centrifugó a 4 °C durante 20 minutos a 10.000 rpm y el sobrenadante resultante se utilizó como preparación enzimática de H. armigera (HEP). El contenido total de proteínas de HEP se calculó mediante el método de Bradford y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

La actividad de amilasa se analizó utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNSA)27. La mezcla de ensayo estuvo compuesta por 125 µl de tampón de fosfato de sodio 0,02 M, pH 6,9, que contenía cloruro de sodio 6 mM y 40 µg de HEP, que se incubó a 37 °C durante 15 minutos. Esta reacción enzimática se terminó con 1,0 ml de reactivo DNSA, seguido de incubación en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos, enfriamiento a temperatura ambiente y dilución de las reacciones 10 veces con agua y se midió la absorbancia a 540 nm. Los azúcares libres liberados al final de la actividad de la enzima amilasa se estimaron utilizando un gráfico de maltosa estándar.

La estimación de la actividad enzimática proteasa total se determinó utilizando Azocaseína como sustrato19,28 con 40 μg de HEP. Brevemente, se agregaron 40 μg de enzima HEP a 200 μl de azocaseína al 1% (preparada en glicina-NaOH 0,2 M, pH 10,0) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 300 µl de ácido tricloroacético al 5%. Después de centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos, se añadió al sobrenadante un volumen igual de NaOH 1 M. La absorbancia se midió a 450 nm y se calculó una unidad de proteinasa como la cantidad de enzima que aumentó la absorbancia en 1,0 OD en las condiciones de ensayo dadas. La actividad de la proteasa se expresó en unidades/μg/min/ml de proteína.

La actividad de GST se estimó utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) (Sigma, Missouri, EE. UU.) como sustrato, siguiendo el método descrito anteriormente29. La mezcla de reacción (1000 µl) contenía tampón fosfato pH = 7 (980 µl), glutión reducido (GSH) 200 mM (10 µl), CDNB 100 mM (10 µl) y HEP 40 µg. En las reacciones de control se añade tampón en lugar de la enzima. La absorción de las mezclas de reacción se adquirió en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 (Cole-Parmer India). Las reacciones se llevaron a cabo en cubetas de cuarzo de 1 ml (Shilpent Quartz Cuvette, Francia) y se registró la absorbancia a 340 nm a intervalos de 30 s durante 15 min a 25 °C. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y la actividad específica de GST se calculó como μM/ml/min utilizando 9,6 mM-1 como coeficiente de extinción para el conjugado CDNB-GSH a 340 nm.

La actividad de la lipasa total se estimó mediante el ensayo de palmitato de p-nitrofenilo (pNPP, Sigma-Aldrich)30. La solución A consta de 0,1 g de goma arábiga y 0,4 ml de Triton X-100 (Hi-media, India) disueltos en 90 ml de agua destilada y la solución B contenía 30 mg de pNPP disueltos en 10 ml de isopropanol31. La solución de sustrato completa se preparó agregando 9,5 ml de solución A a 0,5 ml de solución B gota a gota con agitación constante para obtener una emulsión que fue estable durante dos horas. Utilizando este sustrato se determinó la actividad de la lipasa. Se agregaron 40 μg de HEP a la solución de sustrato y se incubó a 37oC durante 30 min. La reacción se detuvo añadiendo carbonato de sodio al 1% (Na2CO3) y se midió la absorbancia de las muestras a 410 nm.

Se utilizaron p-nitrofenilfosfato y leucina-p-nitroanilida (Sigma-Aldrich) como sustratos, respectivamente, para la detección de actividades enzimáticas específicas de ALP y APN según el protocolo32. Se mezclaron 40 µg de HEP con tampón ALP [MgCl2 0,5 mM, Tris/HCl 100 mM (pH 9,5)] que consistía en fosfato de p-nitrofenilo 1,25 mM o tampón APN [Tris/HCl 0,2 M (pH 8), NaCl 0,25 M]. con 1 mM de leucina-p-nitroanilida. La actividad de la enzima ALP se comprobó como el cambio en la absorbancia a 450 nm durante 3 minutos a 25 °C, mientras que la actividad de la enzima APN se midió a 410 nm comprobando la tasa de generación de p-nitroanilina.

Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico y el nivel de significancia se indicó como *P < 0,05, **P < 0,001 y ***P < 0,0001 al comparar con las lecturas del control EV. Los gráficos se trazaron utilizando una versión de demostración en línea de Graphpad prism y Microsoft Excel. La imagen del modelo fue creada con Biorender.com.

La proteína CanDef-20 expresada de forma recombinante mostró una masa molecular de ~ 14 kDa y su ensayo de transferencia puntual con anticuerpos anti-myc confirmó la presencia y expresión de las proteínas recombinantes (Fig. 1a, b). Las imágenes originales de geles y transferencia de puntos se muestran en la figura complementaria S1. El efecto de CanDef-20 sobre el desarrollo de H. armigera se evaluó midiendo la masa larvaria, la masa de pupas, la fertilidad y la fecundidad en insectos alimentados con varias dosis de la proteína recombinante incorporada en la dieta artificial (15,5, 31,25, 62,25, 125 y 250 µg/ml). Las larvas de H. armigera que ingirieron CanDef-20 recombinante mostraron un efecto dependiente de la dosis sobre la masa larval en comparación con las larvas que ingirieron dietas de control (alimentadas con EV y AD) (Figura complementaria S2). La reducción máxima en la masa de las larvas (37%) se observó cuando las larvas fueron alimentadas con 125 μg/ml de dieta que contenía CanDef-20 (Fig. 2a). De manera similar, también se observó una reducción en la masa de pupas (4% a 12%) en las larvas alimentadas con CanDef-20 (Fig. 2b y Fig. Suplementaria S2). Curiosamente, tras la ingestión de 250 μg/ml de CanDef-20, las larvas de H. armigera indicaron un aumento ligero pero significativo en la masa de larvas y pupas en comparación con las larvas que ingirieron 125 μg/ml de CanDef-20, aunque la masa aún era menor que la del control EV que ingirió larvas. Además, se observó un retraso de alrededor de 48 a 72 h en la pupa en insectos alimentados con 125 y 250 μg/ml de CanDef-20. La puesta y eclosión de huevos también se vieron afectadas en polillas H. armigera criadas a partir de larvas alimentadas con concentraciones más altas de CanDef-20. Se observó una reducción del 12 al 21% en el número total de huevos puestos por polillas H. armigera criadas a partir de larvas alimentadas con CanDef-20 (Fig. 2c). Se observó que la fertilidad de los óvulos se redujo del 13 al 68%. La alimentación con 250 μg/ml de CanDef-20 resultó en el menor número (440) de recién nacidos que emergieron por cada 1000 óvulos (Fig. 2d). Las larvas que se alimentaron con dietas de CanDef-20 de 62,25 μg/ml mostraron una alta mortalidad (24%) entre todas las concentraciones probadas (Fig. 2e). La reducción de la masa de larvas y pupas inducida por la ingestión de CanDef-20 también fue evidente a partir de las morfologías comparativas de las larvas de H. armigera del quinto estadio tardío y sus pupas (Fig. 2f). Se observaron 24 a 72 h de pupación retrasada en las larvas alimentadas con CanDef-20. El día en el que ~ 70% de las larvas entraron a pupación se muestra en la Fig. 2f. Los efectos retardados de la metamorfosis de CanDef-20 en las larvas y pupas de H. armigera también son evidentes en un bioensayo larvario separado con 150 μg/ml y 300 μg/ml de CanDef-20 (Figura complementaria S2).

El análisis SDS-PAGE y de transferencia puntual de proteínas CanDef-20 y EV recombinantes: (a) CanDef-20, proteína EV y escalera de peso molecular de proteínas (carril M, Genei Laboratories Private Limited) se resolvieron en SDS-PAGE al 15% y se visualizaron. por tinción con azul de Coomassie. (b) El anticuerpo primario anti-myc de conejo se usó contra el epítopo myc del vector pPICZ-alfa A en análisis de transferencia puntual. Se utilizó el anticuerpo secundario proporcionado con el kit Western Blot Development (Bangalore genie, India) para visualizar el complejo de anticuerpo primario etiquetado con myc.

Crecimiento y desarrollo de H. armigera en el ensayo de alimentación CanDef-20 en comparación con la dieta de control (AD) y de control EV: (a, b) Las reducciones porcentuales en la masa de larvas y pupas de H. armigera se muestran mediante un gráfico de barras respectivamente. (c) El efecto de la alimentación con CanDef-20 sobre la fecundidad de las larvas de H. armigera se muestra mediante el porcentaje de disminución de los tratamientos respectivos. (d) Para cada tratamiento se registró el número de recién nacidos que eclosionaron por cada 1000 huevos. (e) La mortalidad inducida por diferentes concentraciones de CanDef-20 en larvas de H. armigera. ( f ) Las variaciones morfológicas en las larvas de H. armigera del quinto estadio tardío y sus pupas indicaron el efecto pronunciado de CanDef-20 sobre el crecimiento de larvas y pupas. El porcentaje de reducción en los valores de masa de larvas y pupas son significativamente diferentes del control EV en * para P < 0,05, ** para P < 0,001 y *** para P < 0,0001, respectivamente.

Los experimentos de alimentación demostraron una reducción dependiente de la dosis en la masa de larvas y pupas de H. armigera cuando se ingiere hasta 125 μg/ml de dieta que contiene CanDef-20. Las larvas de H. armigera del cuarto estadio alimentadas durante 9 días con 125 μg / ml de CanDef-20 o alimentadas con una dieta que contenía proteína EV se utilizaron para un análisis transcriptómico comparativo utilizando RNA-seq.

La secuenciación de Illumina de bibliotecas de H. armigera arrojó 1091,8 y 1278,1 millones de pares de lecturas para larvas alimentadas con dieta CanDef-20 y EV, respectivamente. El análisis de ensamblaje de novo de lecturas limpias dio como resultado un total de 1,57,768 transcripciones, de las cuales 65,535 transcripciones ensambladas (41%) tenían > 200 pb de longitud y se anotaron con datos de insectos UniProtKB, lo que resultó en 13,779 anotaciones de transcripción (Tabla 1). De las 13,779 transcripciones anotadas, 6982 mostraron una cobertura de consulta> 75% y se usaron para un análisis comparativo adicional del transcriptoma de DEG entre larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20 y EV. De los 6982 genes, se encontró que el 47% se alineaba con el género Heliothis y el 6,19% se alineaba con el género Helicoverpa. La aplicación de los criterios de log2FC ≥ ± 2 con valor de P ≤ 0,05 y FDR ≤ 0,05 a las 13.779 transcripciones dio como resultado la detección de 2012 transcripciones, de las cuales 56 transcripciones se encontraron reguladas al alza y 529 a la baja.

Al aplicar los criterios de proporciones log2FC ≥ + 0,8 y ≤ − 0,8 a 6982 transcripciones con > 75% de cobertura de consultas, se encontró que 2327 (33,32%) genes estaban regulados negativamente y 659 (9,4%) genes estaban regulados positivamente en CanDef-20. alimentación. Además, se encontró que 1679 genes se expresaban de forma única en larvas alimentadas con CanDef-20 y 1545 genes se expresaban de forma única en larvas alimentadas con control EV.

El análisis BUSCO se aplicó a todas las transcripciones ensambladas y detectó un 19 % completo (154 BUSCO completos y de una sola copia, 39 BUSCO completos y duplicados), mientras que un 24 % estaba fragmentado (243 BUSCO) y un 57 % faltaban (577 BUSCO). de 1013 ortólogos de copia única para artrópodos (Tabla complementaria S4).

El patrón general de expresión genética en las larvas de control y alimentadas con CanDef-20 se determinó mediante agrupamiento jerárquico y los resultados indicaron una regulación negativa prominente de la mayoría de los genes en H. armigera alimentada con CanDef-20 (Fig. 3a). El gráfico del volcán indicó una regulación diferencial significativa de 1702 de 1921 transcripciones con un valor de P ≤ 0,05 (Fig. 3b; Tabla 2). El análisis con criterios ≥ dos veces con valor de P ≥ 0,05 y FDR ≥ 0,05 mostró transcripciones de proteína de unión a hormona juvenil (JHBP), hexamerina, serina proteasa, arilforina y calfotina representadas entre las transcripciones altamente reguladas a la baja, mientras que el dominio de transcriptasa inversa que contiene proteína, putativo La nucleasa HARBI1, el éster carboxílico hidrolasa y la tirosina 3-monooxigenasa estuvieron representadas entre las transcripciones altamente reguladas (Fig. 3c y 3d; Fig. Suplementaria S3; Tabla Suplementaria S1). Además, la proteína suprimible por hormona juvenil, la serina proteasa y algunas isoformas de la glutatión S-transferasa se encontraron únicamente en larvas de control EV con valores muy altos de FPKM que oscilaban entre 6054 y 1386, mientras que algunas isoformas de la arginina quinasa, la endonucleasa-transcriptasa inversa y la serina proteasa se encontraron de forma única. detectado de forma única en larvas alimentadas con CanDef-20 y tenía valores altos de FPKM que oscilaban entre 211 y 83. Se reguló positivamente una única transcripción de GST (TRINITY_DN83033_c9_g1_i1 con FPKM 2.44) y también se encontró otra isoforma de GST (TRINITY_DN82857_c2_g2_i2 con FPKM 8.44) entre los genes expresados ​​de forma única en larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20.

Análisis transcriptómico: (a) Análisis de agrupamiento jerárquico de genes expresados ​​diferencialmente entre larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20 y con control EV. (b) El gráfico del volcán muestra una expresión genética estadísticamente significativa. La regulación hacia abajo y hacia arriba se indica con puntos verdes y rojos respectivamente. (c) y (d) Los 25 principales DEG regulados hacia abajo y hacia arriba se muestran mediante un gráfico circular respectivamente. Se indica el número de transcripciones que aparecieron para un gen en particular.

Se llevó a cabo un enriquecimiento comparativo de GO para genes expresados ​​diferencialmente con criterios de proporciones log2FC ≥ + 0,8 y ≤ − 0,8 y se representan los 10 GO principales (Figs. 4 y 5). La mayoría de los 10 GO principales del conjunto expresado diferencialmente estuvieron representados por genes regulados negativamente en H. armigera tras la ingestión de CanDef-20 (excepto la unión del ácido nucleico GO, que estaba regulada positivamente) (Fig. 4); mientras que el conjunto expresado de forma única estuvo representado por la mayoría de los genes inducidos por CanDef-20 (Fig. 5). Se descubrió que el componente integral de la membrana, la unión de ATP y la traducción eran los GO regulados diferencialmente más prominentes en las larvas alimentadas con CanDef-20 (Fig. 4a). Las subcategorías de los principales GO regulados de manera diferencial se representan en la Fig. 4b. La unión de GO ATP se subcategoriza en procesos enzimáticos dependientes de ATP como la proteína quinasa, la ATPasa activadora del proteasoma y la helicasa; mientras que el componente integral GO de la membrana incluía subGO como genes asociados a la membrana mitocondrial, complejo de peptidasa de señal, ATPasa tipo V transportadora de protones, membrana plasmática y complejo de unión de microtúbulos. Los GO expresados ​​de forma única mostraron prominencia del componente integral de la membrana, la unión de ATP y el proceso metabólico de carbohidratos (Fig. 5a yb).

Enriquecimiento de ontología genética de DEG de insectos alimentados con CanDef-20 en comparación con el control EV: (a) Clasificaciones de transcripciones de ontología genética (GO) en tres categorías, como función molecular, componente celular y proceso biológico. El eje X corresponde al número de DEG que aparecieron en el análisis, mientras que el eje Y representa diferentes GO. Las barras rojas y azules muestran regulación hacia arriba y hacia abajo respectivamente. (b) La subcategorización de los GO más importantes se analiza más a fondo y se muestra en forma de gráfico circular. Se indica el nombre y la aparición de sub GO.

Enriquecimiento de ontología genética de DEG expresados ​​de forma única en insectos alimentados con CanDef-20 y EV: (a) Clasificaciones de transcripciones de ontología genética (GO) en tres categorías, como función molecular, componente celular y proceso biológico. El eje X corresponde al número de DEG que aparecieron en el análisis, mientras que el eje Y representa diferentes GO. Las barras rojas y azules mostraban una expresión única en el control EV y en la alimentación con CanDef-20, respectivamente. (b) La subcategorización de los GO más importantes se analiza más a fondo y se muestra en forma de gráfico circular. Se indica el nombre y la aparición de sub GO.

Algunos GO prominentes, a saber, quinasas, ATPasas, serina-endopeptidasas, componentes integrales de membrana, lipasas y transposones, aparecieron en conjuntos expresados ​​de manera diferencial y única. Se detectaron diferentes isoformas de los genes mencionados anteriormente y se encontró que tenían niveles de expresión variables representados por los mapas de calor (Fig. 6a yb; Tabla complementaria S2). Las isoformas de genes reguladas negativamente se equilibraron con algunas isoformas reguladas positivamente, lo que indica una respuesta compensatoria inducida por CanDef-20 en H. armigera. Por ejemplo, en los elementos transponibles GO, se encontró que las isoformas estaban altamente reguladas al alza, mientras que en la lipasa GO, curiosamente, solo se encontró que tres isoformas estaban reguladas al alza (LP1, TLP y LP2) y > 15 reguladas a la baja. LP1 y TLP no se caracterizan a partir de H. armigera (Tabla complementaria S2), aunque mostraron homología con la lipasa-1 (NM_001043501.1) y la triacilglicerol lipasa (XM_038014482.1), que se encuentran respectivamente en Bombyx mori. La tercera lipasa regulada positivamente (LP2) tiene homología con las triacilglicerol lipasas de H. armigera (XM_047184139.1).

Patrón de expresión diferencial y único de algunas categorías de genes seleccionadas: (a) La regulación diferencial inducida por CanDef-20 de genes de H. armigera de GO seleccionados está representada por los mapas de calor. Se muestran diferentes isoformas genéticas de quinasas, ATPasas, serina-endopeptidasas (SEP), componentes integrales de membrana (ICM), lipasas y transposones (TRSP) sobre la base del cambio de log2 veces. La regulación hacia arriba y hacia abajo se muestra mediante un gradiente de color verde y rojo respectivamente. (b) El patrón de expresión único de diferentes isoformas genéticas de quinasas, ATPasas, serina-endopeptidasas (SEP), componentes integrales de membrana (ICM), lipasas y transposones (TRSP) se detectan en larvas alimentadas con control CanDef-20 y EV por separado y se representan por los mapas de calor. El patrón de expresión único en las larvas alimentadas con CanDef-20 se muestra mediante un gradiente rojo. El gradiente verde se utiliza para mostrar una expresión única en larvas alimentadas con EV.

Se analizó HEP de H. armigera alimentado con CanDef-20 y proteína de control EV para detectar actividades de amilasa, proteasa, lipasa, GST, aminopeptidasa y fosfatasa alcalina (Fig. 7). Se encontró un aumento significativo en las actividades enzimáticas totales de todas estas enzimas en las larvas alimentadas con CanDef-20. La amilasa, la proteasa, la GST y la aminopeptidasa mostraron un aumento de alrededor del 50 al 63 %, mientras que las lipasas y las fosfatasas alcalinas mostraron un aumento del 35 % y el 24 % respectivamente en las larvas alimentadas con CanDef-20. Los datos de la secuencia de ARN indicaron una importante regulación a la baja de la mayoría de las isoformas de los genes de estas enzimas en respuesta a la alimentación con Candef-20 (Fig. 6). Sin embargo, se encontró que algunos genes codificadores de isoformas enzimáticas específicas estaban regulados positivamente para todas las enzimas seleccionadas (excepto las amilasas). Estas isoformas de enzimas selectivamente reguladas positivamente que codifican genes habrían contribuido de manera más destacada al aumento de la actividad neta in vitro de estas enzimas.

Efecto de la alimentación con CanDef-20 sobre las actividades enzimáticas: La preparación enzimática de H. armigera (HEP) se utilizó en los ensayos para detectar (a) amilasa, (b) proteasa, (c) lipasa, (d) glutatión S-transferasa ( GST), (e) aminopeptidasa y (f) actividades enzimáticas de fosfatasa alcalina y se muestra mediante un gráfico de barras. Se analizaron las actividades enzimáticas de la dieta artificial (AD), la dieta incorporada con CanDef-20 recombinante (CanDef-20) y las proteínas expresadas con vector vacío (EV). Los valores de actividad enzimática total son significativamente diferentes del control EV en * para P <0,05, ** para P <0,001 y *** para P <0,0001 respectivamente.

Se estudiaron los niveles relativos de expresión génica de JHBP, hexamerina, calfotina, quinasas, ATPasas, componentes integrales de membrana, lipasas, serina endopeptidasas y transposones de larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20 (a 125 μg/ml y 250 μg/ml) y Control de EV mediante RT-qPCR (los detalles del cebador se proporcionan en la Tabla complementaria S3). Se descubrió que la expresión genética de JHBP, hexamerina y calfotina estaba regulada negativamente en H. armigera tras la ingestión de CanDef-20 y esto es consistente con sus datos de secuencia de ARN (Fig. 8a).

Validación de la expresión del gen RNA-seq mediante análisis de qPCR: se realiza un análisis de qPCR para genes seleccionados para validar los datos de RNA-seq. (a) Proteína fijadora de hormona juvenil (JHBP), hexamerina, calfotina, arginina quinasa, piruvato quinasa, adenilato quinasa 6, (b) protón ATPasa tipo V y sus subunidades C y B. (c) aminopeptidasa 2, fosfatasa alcalina 2 y aminopeptidasa (d) N lipasa, lipasa (LP2), lipasa. (e) tripsina, serina proteasa. (f) ATP sintasa. (g) Endonucleasa transcriptasa inversa (ERT 4, ERT 12 y ERT 2). Los valores relativos de expresión génica son significativamente diferentes del control EV en * para P <0,05, ** para P <0,01, *** para P <0,001 y nd para ninguna diferencia, respectivamente.

Las isoformas de la arginina quinasa, la piruvato quinasa, la ATPasa tipo V y su subunidad C estaban reguladas negativamente y esto es consistente con sus datos de RNA-seq, pero la adenilato quinasa y la subunidad B de la ATPasa tipo V mostraron niveles de expresión contrastantes en qPCR versus ARN. -análisis de secuencia (Fig. 8a, b).

Los niveles de expresión génica de isoformas de proteínas de membrana como aminopeptidasa, fosfatasa alcalina 2 y mucina también se regularon negativamente y es consistente con los datos de RNA-seq (Fig. 8c).

Se encontró que diferentes isoformas de lipasas (lipasa, N lipasa y LP2), serina proteasa y tripsina estaban reguladas hacia arriba o hacia abajo y eso es consistente con sus respectivos datos de RNA-Seq (Fig. 8d y e).

De manera similar, la ATP sintasa también mostró una regulación negativa de la expresión génica que se correlaciona con los datos de RNA-seq (Fig. 8f). El análisis de qPCR mostró un patrón de expresión contrastante de todas las isoformas probadas de los genes de la transcriptasa inversa de endonucleasa (ERT4, 12 y 2) con sus datos de RNA-seq respectivamente (Fig. 8g).

Las plantas emplean un arsenal de biomoléculas para presentar una respuesta de defensa contra plagas y patógenos; algunas de estas moléculas tienen un objetivo específico mientras que otras tienen una acción amplia. Las defensinas vegetales son más conocidas por sus propiedades antifúngicas33, aunque también poseen potencial de retardo del crecimiento de los insectos. En el presente estudio, la ingestión de una defensina de C. annuum (CanDef-20 recombinante) produjo un efecto negativo dependiente de la dosis sobre el crecimiento y desarrollo de la plaga de insectos H. armigera, similar a la antibiosis de insectos lepidópteros y coleópteros informada anteriormente34,35. H. armigera alimentada con concentraciones muy altas de CanDef-20 (250 µg/ml) se desvió de la tendencia de reducción de la masa larval dependiente de la dosis, muy probablemente debido a las respuestas moleculares adaptativas inducidas por la defensina (que se analizan más adelante).

Aunque el retraso del crecimiento de los insectos es un efecto destacado debido a la alimentación con una dieta que contiene defensina, los mecanismos moleculares implicados en los cambios metabólicos mediados por la defensina de las plantas en los insectos, como el retraso en las etapas de la vida, el retraso del crecimiento, la reducción de masa y la pérdida de fecundidad, siguen siendo en gran medida desconocidos. La transcriptómica comparativa reveló cambios en las vías y procesos inducidos por la ingestión de CanDef-20 en larvas de H. armigera. Se sabe que los AMP como las defensinas interactúan con diferentes componentes celulares como la membrana celular y las proteínas citoplasmáticas y también pueden ingresar al núcleo e interactuar con el ADN36,37,38,39. La ingestión del péptido CanDef-20 media múltiples efectos sobre el metabolismo de H. armigera a través de interacciones proteína/enzima secretadas por defensina, interacciones defensina-membrana y regulación de la expresión del gen diana inducida por defensina (Fig. 9).

Diagrama modelo que representa la reprogramación metabólica/vías afectadas por la ingestión de CanDef-20 en H. armigera: se muestran categorías de genes seleccionados como transposones, quinasa, componentes integrales de la membrana, serina endopeptidasa, lipasa, ATPasa y se muestra el papel de las proteínas clave involucradas en el proceso. resaltado. La regulación ascendente y descendente de proteínas y enzimas específicas se muestra mediante flechas rojas y azules respectivamente.

Uno de los modos conocidos de actividad de las defensinas de las plantas sobre los insectos es la inhibición de sus enzimas digestivas como las amilasas y las proteinasas17,40,41,42. En el presente estudio, las larvas alimentadas con CanDef-20 mostraron mayores actividades de amilasa y proteinasa intestinal. Sin embargo, los datos de transcriptómica revelaron una importante regulación a la baja de las transcripciones de alfa-amilasa y serina endopeptidasa (serina proteasas y tripsina) y una notable regulación positiva de algunas isoformas de quimotripsina y serina proteasa. Esto indicó ajustes metabólicos compensatorios realizados por H. armigera para equilibrar la digestión en presencia de CanDef-20. Los ajustes en la expresión de isoformas de proteinasa a niveles de genes y transcripciones en insectos son comunes tras la exposición a inhibidores de proteinasas43,44. De manera similar, las enzimas amilasa intestinales modulan su expresión en respuesta a la ingestión de un inhibidor de amilasa vegetal45.

El potencial inhibidor de la lipasa de insectos de las defensinas de las plantas no se ha informado anteriormente, aunque observamos una regulación negativa de la mayoría de las transcripciones de lipasa de H. armigera (lipasa neutra, lipasas y triacilglicerol lipasas) tras la ingestión de CanDef-20. Además, se observó un aumento neto simultáneo en la actividad de la lipasa en larvas alimentadas con CanDef-20, lo que puede atribuirse a las isoformas LP1, LP2 y TLP del transcrito de lipasa reguladas positivamente compensatorias (clasificadas como actividad de éster hidrolasa carboxílico [GO:0052689]). Las hidrolasas de éster carboxílico también participan en la desintoxicación de varios insecticidas, impartiendo desarrollo de resistencia en insectos46. También se sabe que se necesitan diferentes isoformas de enzimas lipasas para la movilización de lípidos en insectos sometidos a estrés por inanición47. Las lipasas TAG y una fosfolipasa se regulan positivamente durante la inanición en D. melanogaster y pueden estar involucradas en la movilización de lípidos48,49. Por lo tanto, la ingestión de CanDef-20 parece inducir estrés similar a la inanición y estrés por toxinas en H. armigera, que se manifiesta además en la expresión diferencial de lipasa y la degradación de lípidos mediada por éster carboxílico hidrolasa.

Los recursos genómicos y transcriptómicos disponibles para H. armigera no son suficientes para mapear el rango de transcripciones expresadas tras la ingestión de CanDef-20, ya que el 64% de las transcripciones expresadas diferencialmente identificadas en el presente estudio son genes no caracterizados. El recurso genoma50 de H. armigera publicado recientemente puede ser útil para anotar algunos de los genes no caracterizados del presente estudio.

Estudios recientes han demostrado que las defensinas interactúan con patógenos microbianos y/o membranas de células tumorales uniéndose a fosfolípidos específicos para provocar la permeabilización de la membrana que conduce a la muerte celular38,51,52. El mecanismo de alteración de la membrana varía según la composición de la membrana y las moléculas de defensina que interactúan. La cinética de interacción de la membrana fúngica se conoce para dos defensinas de plantas, (i) la defensina de guisante PsD1 que interactúa con membranas que contienen el esfingolípido glucosilceramida (GluCer)53 y (ii) MtDef4 de Medicago truncatula que interactúa con el ácido fosfatídico (PA) de membrana15. Observamos que los componentes integrales de la membrana (GO: 0,016,021) son un GO altamente regulado a la baja en larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20, y representan proteínas de membrana como las ATPasas de protones tipo V (V-ATPasas), cadherina, ALP y APN. proteínas.

Bombas de protones transmembrana V-ATPasas que desempeñan funciones importantes en numerosos procesos biológicos, como la degradación y síntesis de proteínas, los cambios en el pH de los orgánulos, el crecimiento celular y la autofagia celular54. La ingestión de CanDef-20 provocaría una alteración en la homeostasis de la energía celular en H. armigera, que puede correlacionarse con la regulación negativa de las V-ATPasas. Las V-ATPasas y su subunidad se regularon negativamente durante la inanición en el gusano del tabaco Manduca sexta55. Curiosamente, el ARNi dirigido a la V-ATPasa en H. armigera redujo la masa larvaria y la capacidad de supervivencia de las larvas56, lo que se correlaciona con los hallazgos del presente trabajo.

Las proteínas cadherina, ALP y APN son receptores funcionales para la toxina Cry1A en Helicoverpa armigera y su interacción con la toxina cry media la formación de poros en la membrana intestinal que conduce a la muerte del insecto5. La regulación negativa de estos receptores y la expresión de sus isoformas mutadas conduce al desarrollo de resistencia contra la toxina Cry1A en insectos lepidópteros4,57,58. La regulación negativa inducida por la ingestión de CanDef-20 de los receptores de cadherina, ALP y APN en H. armigera es indicativa del efecto tóxico de CanDef-20. Además, se observa que las transcripciones de cadherina mutante y algunas isoformas de ALP y APN están reguladas positivamente en H. armigera tras la ingestión de CanDef-20, lo que revela similitudes en los procesos desencadenados por la toxina Cry1A y CanDef-20. Se informa una regulación negativa simultánea similar de APN1 y una regulación positiva compensatoria de APN6 en el looper de repollo resistente a Cry1A, Trichoplusia ni6.

Las GST son las otras enzimas con potencial de desintoxicación xenobiótica59. La regulación negativa de varias isoformas de GST y la regulación positiva selectiva de dos isoformas de GST tras la ingestión de CanDef-20 en H. armigera también indica el estrés tóxico de CanDef-20 y la correspondiente respuesta adaptativa del insecto, como también lo representa la alta actividad de la proteína GST ( Figura 7).

La ingestión de CanDef-20 provoca un cambio en la expresión de algunas de las enzimas citoplasmáticas como la arginina quinasa (AK), la piruvato quinasa (PK), la superóxido demutasa (SOD), la espermina oxidasa y la quitina sintasa (CHS).

La AK es una fosfágeno quinasa de invertebrados implicada en el transporte y amortiguación de energía mediante la estabilización de la relación ATP/ADP celular60. Un estudio de interferencia de ARN (ARNi) dirigido a la AK en el escarabajo coleóptero Phyllotreta striolata resultó en mortalidad y pérdida de fecundidad61. La PK cataliza el piruvato de fosfoenol a piruvato, reacción de glucólisis, lo que conduce al ciclo de TCA62. La inhibición de la PK conduce a una disminución de los niveles de ATP y a un desequilibrio en el metabolismo energético en Tribolium castaneum63. Los bajos niveles de piruvato en los cerebros de las pupas de H. armigera dieron como resultado una extensión de la esperanza de vida al iniciar la diapausa64. La masa reducida de larvas y pupas junto con el retraso en la pupa en H. armigera alimentada con CanDef-20 puede correlacionarse con la regulación negativa de AK y PK.

Las defensinas vegetales pueden causar efectos celulares, incluida la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que desencadenan una señalización secundaria y un desequilibrio de la homeostasis iónica, lo que en última instancia contribuye a la muerte celular65. La enzima SOD ayuda a combatir la generación de ROS66. Las defensinas vegetales como RsAFP2 y Vu-Defr también son capaces de inducir ROS en Candida albicans67 y Leishmania amazonensis68 respectivamente. La regulación positiva de SOD tras la ingestión de CanDef-20 en H. armigera implica que la defensina genera estrés oxidativo en las larvas y la elevada expresión de SOD alivia el estrés de ROS.

La interferencia en la actividad de la maquinaria ribosómica puede afectar el crecimiento y desarrollo de los insectos69. En Drosophila, el nivel de transcripción de los ribosomas y la síntesis de proteínas se regula negativamente cuando se carece de aminoácidos en la dieta70. La disminución en el nivel de transcripción de los ribosomas es el resultado del estrés nutricional planteado por la alimentación de CanDef-20 por parte de H. armigera.

CHS mantiene la integridad de la matriz de quitina y regula la metamorfosis de larva a pupa, la eclosión de los huevos y la fecundidad71. El silenciamiento de los genes CHS dio lugar a fenotipos malformados y a un aumento de la mortalidad con una menor tasa de muda en la ninfa de Locusta migratoria manilensis72 y la puesta de huevos en el ácaro rojo Panonychus citri73. La extensión del período larvario y la disminución de la puesta de huevos pueden ser una consecuencia de la regulación negativa del gen CHS en larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20 (Fig. 2).

La proteína fijadora de hormona juvenil (JHBP) en asociación con la hormona juvenil (JH) y proteínas de almacenamiento como hexamerina, arilforina y apolipoforina son esenciales para múltiples procesos fisiológicos en insectos, incluido el desarrollo larvario, la metamorfosis y la reproducción adulta74. Se ha informado que la regulación negativa de JHBP conduce a retrasos en el desarrollo de las larvas de H. armigera74. Además, se encontró que la hexamerina estaba significativamente regulada a la baja en el escarabajo aserrador del pino (Monochamus alternatus) cuando se alimentaba con insecticidas (cloramina-fósforo)75, y la arilforina estaba regulada a la baja en larvas de Spodoptera exigua tratadas con la toxina Vip3Aa76. Por lo tanto, la regulación negativa de JHBP, hexamerina y arilforina podría tener un impacto en la metamorfosis de las larvas de H. armigera, lo que lleva a una etapa larvaria prolongada. Sin embargo, las transcripciones reguladas al alza de los receptores de proteína quinasa, serina-treonina quinasa y proteína G ayudan a avanzar hacia la etapa de pupa.

La endonucleasa transcriptasa inversa (retrotransposones) y el elemento transponible (TE) fueron las transcripciones reguladas al alza más representadas en larvas de H. armigera alimentadas con CanDef-20. Los TE a través de mutagénesis de inserción y recombinación cerca de los genes funcionales contribuyen a la generación de nuevas mutaciones y son responsables de generar gran parte de la diversidad genética que contribuye a la rápida evolución77. La inserción de TE cerca de genes de desintoxicación como P450 confirió adaptación y resistencia a los insecticidas en polillas H. zea y moscas D. melanogaster78. La inserción de transposones en los genes de cadherina del receptor de la membrana intestinal conduce a la resistencia a Bt en el gusano rosado de la cápsula79. Observamos que la alimentación con CanDef-20 desencadenó la movilización de TE de tipo ARN como LINE jockey, LTR gypsy y LINE RTE en H. armigera. H. virescens mostró una regulación positiva de los retrotransposones y los transposones de ADN en respuesta a la ingestión de glucosinolatos de Arabidopsis thaliana80. El aumento de la expresión y transposición de TE en respuesta a CanDef-20 puede generar diversidad genética hereditaria en larvas de H. armigera y conferir más ventajas selectivas a los insectos, lo que necesita más investigaciones.

La alteración en el metabolismo del estadio larvario debido a la presencia de inhibidores o toxinas en la dieta a menudo compensa su ciclo de vida. Nuestros hallazgos demuestran que la ingestión de CanDef-20 exhibió una inhibición del crecimiento de larvas y pupas en larvas de H. armigera. El análisis transcriptómico comparativo indicó una regulación negativa y una regulación positiva diferencial de genes implicados en diversas vías metabólicas, incluida la homeostasis energética y las enzimas relacionadas con la digestión de los alimentos, y la desintoxicación xenobiótica tras la exposición a CanDef-20. Concluimos que el retraso en el crecimiento y desarrollo de las larvas de H. armigera que ingieren CanDef-20 está mediado por sus interacciones con proteínas/enzimas secretadas, componentes de la membrana y la regulación de la expresión del gen diana mediada por factores de transcripción y transposones. Nuestro estudio proporciona una base para futuras investigaciones sobre las posibles aplicaciones prácticas del control mediado por el péptido defensina de plagas dañinas como H. armigera.

Los datos del ensamblaje del transcriptoma generados durante el estudio actual están disponibles en SRA (base de datos NCBI) bajo el bioproyecto PRJNA869208. Archivos de datos adicionales sobre el ensamblaje del transcriptoma están disponibles en datos de Mendeley https://doi.org/10.17632/gwjdhw6rw3.1.

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Descargar referencias

JM y VT agradecen al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST), a la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB), al Gobierno de la India por proporcionar la financiación (CRG/2018/002324) y al Programa Departamental de Investigación y Desarrollo (DRDP), Instituto de Bioinformática. y Biotecnología (IBB), Universidad Savitribai Phule Pune (SPPU), Pune, Maharashtra, India, por financiar y apoyar este trabajo. Agradecemos al Jefe del Departamento de Microbiología por permitirnos utilizar la máquina qPCR. También agradecemos al Sr. Onkar Ghuge y a la Srta. Rutuja Shirke por ayudar en el mantenimiento del cultivo de insectos y el ensayo enzimático.

Departamento de Biotecnología (fusionado conjuntamente con el Instituto de Bioinformática y Biotecnología (IBB)), Universidad Savitribai Phule Pune, Pune, Maharashtra, 411007, India

Javed A. Mulla y Vaijayanti A. Tamhane

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JM – Experimentación, Análisis de datos, Figuras y Escritura de manuscritos. FP – Supervisión, Conceptualización, Análisis de datos, Figuras y Redacción del manuscrito, Administración de proyectos y Adquisición de financiación.

Correspondencia a Vaijayanti A. Tamhane.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mulla, JA, Tamhane, VA Nuevos conocimientos sobre la ingestión de defensinas vegetales indujeron respuestas metabólicas en la plaga de insectos polífagos Helicoverpa armigera. Representante científico 13, 3151 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29250-3

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Recibido: 10 de septiembre de 2022

Aceptado: 01 de febrero de 2023

Publicado: 23 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29250-3

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