Estructura cristalina de una subtilisina. | Cuentas de cuarzo Weifang Co., Ltd.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1163 (2023) Citar este artículo

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Los autotransportadores (AT) son una gran familia de proteínas de membrana externa y secretadas por bacterias que abarcan una amplia gama de actividades enzimáticas frecuentemente asociadas con fenotipos patógenos. Presentamos la caracterización estructural y funcional de un autotransportador de subtilasa, Ssp, del patógeno oportunista Serratia marcescens. Aunque las estructuras de las subtilasas han sido bien documentadas, esta proteína similar a la subtilisina está asociada con una hélice β de 248 residuos y en sí misma incluye tres protuberancias en forma de dedos alrededor de su sitio activo involucrado en las interacciones con el sustrato. Además, revelamos que la actividad de la subtilasa AT es necesaria para la entrada a las células epiteliales y para causar toxicidad celular. La estructura de Ssp no solo proporciona detalles sobre las AT de subtilasa, sino que también revela un marco y una función comunes a las AT relacionadas más lejanamente. Como tales, estos hallazgos también representan un importante paso adelante hacia la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la divergencia funcional en la gran superfamilia AT.

Las subtilasas son un grupo diverso de proteasas principalmente extracelulares que se encuentran en bacterias, arqueas y eucariotas. El grupo de proteínas similares a la subtilisina constituye la segunda familia más grande de serina proteasas después de la familia de proteasas (quimo)tripsina1. Las subtilasas desempeñan un papel en una amplia gama de funciones biológicas, incluidas infecciones bacterianas y virales, tumorigénesis y metástasis, patogénesis de enfermedades, crecimiento y desarrollo de plantas, y también se utilizan en la industria de todo el mundo como aditivos en detergentes para ropa y lavavajillas2,3,4,5. 6. Aunque las subtilasas se han investigado exhaustivamente, se encuentra un grupo único y en gran medida no caracterizado de subtilasas como parte de la superfamilia de proteínas autotransportadoras (AT) bacterianas.

Los autotransportadores (AT) son la familia más grande de proteínas secretadas en bacterias Gram-negativas y muchas de ellas desempeñan funciones importantes en infecciones y enfermedades bacterianas, incluida la adhesión e invasión de células huésped y la formación de biopelículas, además de ser potentes citotoxinas e inmunomoduladores6,7. Los AT tienen una estructura de dominio conservada que incluye un péptido señal para el transporte dependiente de Sec a través de la membrana bacteriana interna y un dominio translocador C-terminal para la secreción de un dominio pasajero a través de la membrana externa (Fig. 1a). El pasajero transportado en la superficie es responsable de las diferentes funciones en la patogénesis bacteriana (Fig. 1a), mediante las cuales las arquitecturas de dominio específicas permiten que los AT posean funciones distintas, incluidas actividades enzimáticas como la actividad de proteasa, lipasa y fosfatasa.

Las AT de subtilasa comprenden una de las dos familias de AT que poseen actividad proteasa, siendo la otra las AT de proteasa similares a (quimo) tripsina que incluyen SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobactericeae). Podría decirse que el último grupo son los AT mejor caracterizados, que integran una hélice β de tres cadenas con un subdominio de proteasa N-terminal como parte de su pasajero8. Por ejemplo, los SPATE, como la toxina codificada por plásmido (Pet), contienen una hélice β de ~600 residuos con un subdominio N-terminal similar a (quimo)tripsina que escinde sustratos, incluida la espectrina, lo que conduce a una alteración del citoesqueleto9. En comparación, hay menos información sobre las subtilasas AT, un gran grupo de proteínas que se encuentran en patógenos bacterianos que van desde Pseudomonas spp10,11,12,13,14, Neisseria meningitidis15 y Bordetella pertussis16, entre otros. Algunas de las AT de subtilasa mejor estudiadas incluyen B. pertussis SphB1 y N. meningitidis NalP, ambas lipidadas17,18 y que han demostrado escindir diferentes proteínas de superficie como la hemaglutinina filamentosa16 y la proteasa IgA o la proteína de unión a lactoferrina LbpB, respectivamente15,19. En general, las investigaciones hasta la fecha muestran que muchas AT de subtilasa parecen tener funciones en la patogénesis bacteriana, como provocar efectos citopáticos en las células huésped, confiriendo resistencia sérica y formación de biopelículas, funciones que también parecen ser comunes a las proteasas tipo (quimo)tripsina10. ,13,20,21,22,23.

La primera subtilasa AT caracterizada fue Ssp (PrtS) de Serratia marcescens IFO-3046. S. marcescens es un patógeno oportunista que puede infectar una variedad de animales y plantas24,25, y en humanos se sabe que S. marcescens causa diversas infecciones, incluidas enfermedades respiratorias, infecciones del torrente sanguíneo y del tracto urinario, y de manera alarmante ha desarrollado resistencia a muchos medicamentos de uso común. antibióticos24,26. Se desconoce el papel de la Ssp en estas infecciones; sin embargo, una variante de Ssp de Serratia sp. Se descubrió que A88copa13 (98 % de identidad en pasajeros) aislada de pinos era la principal responsable de la citotoxicidad hacia el nematodo Bursaphelenchus xylophilus, el agente causante de la enfermedad del marchitamiento de los pinos27. Estudios previos sobre Ssp se han centrado en gran medida en su mecanismo de transporte desde la membrana citosólica interna a la membrana bacteriana externa y su liberación desde la superficie celular28,29,30,31,32. Al igual que otras subtilasas AT, se cree que la Ssp permanece adherida transitoriamente a la superficie bacteriana, antes de escindirse y liberarse al medio ambiente28. Sin embargo, al igual que con otras AT de sutilasa, no existen datos estructurales y pocos datos funcionales para Ssp33.

Aquí, en nuestra investigación de Ssp, describimos el análisis detallado de estructura/función de una subtilasa AT. Revelamos que Ssp se pliega en un dominio de subtilasa único seguido de una hélice β corta, un diseño general parecido al de los SPATE. Además, mostramos que ambos tipos de proteasa AT también comparten similitudes funcionales, donde revelamos que Ssp puede ingresar a las células epiteliales y causar efectos citopáticos que dependen de su actividad subtilasa. Estos hallazgos no sólo sirven para cerrar la brecha entre estos dos grandes grupos de AT, sino que también aumentan la diversidad de subtilasas y proteasas similares a subtilisina.

Para comenzar a comprender los detalles moleculares del subgrupo AT subtilasa, en su mayoría inexplorado, se utilizó el gen que codifica la Ssp de longitud completa de S. marcescens IFO-304628, que incluía la secuencia señal N-terminal, seguida de los dominios pasajero y translocador. subclonado en pBAD/Myc-His-B y expresado en E. coli BL21(DE3). Se aisló y purificó del sobrenadante del cultivo una proteína secretada de 66 kDa sobreexpresada que correspondía a la forma madura del pasajero Ssp escindido para su posterior caracterización. El análisis LC-MS / MS de digestión tríptica confirmó el pasajero Ssp (75% de cobertura de secuencia) con datos consistentes con la escisión en Ala27 y Asp645 liberando al pasajero del translocador31 (Fig. 1a). Esta autoproteólisis se ha observado previamente para Ssp30, y el mecanismo está bien caracterizado para otros autotransportadores de serina proteasa34. También se descubrió que la Ssp recombinante era proteolíticamente activa utilizando un sustrato fluorogénico a base de caseína (ver a continuación la Fig. 3c).

Para determinar la estructura tridimensional de Ssp mediante cristalografía de rayos X, se obtuvieron cristales isomorfos para el pasajero Ssp marcado con selenometioniona (SeMet) y sin marcar. Se construyó un modelo parcial preliminar de Ssp basado en el autotransportador IcsA (PDB: 5KE1)35 utilizando el servidor de modelos de homología SWISS-MODEL36. Se fusionaron varios conjuntos de datos de SeMet, que se utilizaron junto con el modelo Ssp para resolver la estructura mediante reemplazo isomorfo único con dispersión anómala (SIRAS) y reemplazo molecular con difracción anómala de longitud de onda única (MRSAD). Una molécula de Ssp está presente en la unidad asimétrica, donde la estructura resultante se refinó frente a un conjunto de datos nativo de mayor resolución (2,0 Å) con un Rfactor/Rlibre final de 16,3/20,1 (estadísticas cristalográficas en la Tabla 1).

Esta estructura de Ssp reveló que está compuesta por un dominio de proteasa similar a subtilisina N-terminal y un dominio helicoidal β de tres hebras C-terminal (Fig. 1b). El dominio subtilasa de Ssp se coloca directamente encima del dominio helicoidal β, esencialmente cubriendo el andamio helicoidal β (Fig. 1b). Tanto el dominio subtilasa como la disposición arquitectónica de este dominio con el dominio β-helicoidal no se ha observado en las estructuras AT determinadas hasta la fecha, y difiere de los SPATE que tienen sus subdominios, incluido el dominio serina proteasa, que sobresalen del lado de la Tallo helicoidal β (Figura 1 complementaria) 37,38,39,40,41. No obstante, la presencia de la hélice β en Ssp confirma la relación de las AT de subtilasa con otros grupos AT importantes, como los SPATE y los AT autoasociados.

a Esquema lineal de la secuencia primaria de Ssp que abarca un péptido señal (SP) N-terminal y un dominio translocador C-terminal que flanquea al pasajero central. Los residuos del sitio activo en el dominio subtilasa se muestran con una línea roja, los sitios de autoescisión se muestran con flechas verdes. b Estructura cristalina que muestra la arquitectura general del pasajero Ssp en representación de dibujos animados. El dominio de subtilasa (proteasa) se representa en azul y los residuos del sitio activo se muestran como esferas rojas. El dominio del tallo de la hélice β está representado en amarillo, con el bucle 1 y el bucle 2 de la hélice β sobresalientes, de color óxido y verde, respectivamente. La repetición de transporte asociada al pasajero (PATR) se muestra en rosa y el motivo RGD se muestra como palos rosas, el bucle de hélice α en naranja y la tapa de horquilla β en la base del pasajero están coloreados en azul oscuro. Los iones de calcio se muestran como esferas rosadas y los unidos al dominio de proteasa se marcan con Dohnalek et al. nomenclatura57. c Dominio proteasa de Ssp en representación de dibujos animados que muestra las protuberancias únicas del sitio activo (E1-E3). Es decir, extensión de horquilla β corta (E1, rosa), extensión de horquilla β larga (E3, verde) y extensión de bucle extendido con hélice α conectada (E2, naranja). El sitio activo se muestra como barras rojas. d Dominio de proteasa Ssp con lámina β central y hélices α que se muestran en rosa intenso y jade, respectivamente. El enlace disulfuro se muestra como barras amarillas.

La arquitectura central del dominio proteasa de Ssp es típica de los pliegues tipo subtilisina observados en otras enzimas subtilasas42. Está compuesto por un pliegue globular α/β centralmente que presenta una lámina β paralela retorcida de siete hebras adyacente a dos hélices α centrales y que abarca los residuos del sitio activo D76, H112 y S341 (Figs. 1c, d y 2c). Un enlace disulfuro (Cys288 a Cys295) conecta la última hebra β de la lámina β con su bucle anterior (Fig. 1d). El análisis DALI43 reveló que la proteína estructuralmente más similar a Ssp es la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (31% de identidad, PDB: 1LW6, puntuación Z: 32,3) con un rmsd de 2,0 Å sobre 255 átomos de Cα. La superposición de las dos estructuras confirma un núcleo central α/β similar con los residuos del sitio activo de Ssp superpuestos bien con los de subtilisina BPN '(Fig. 2a, b).

a Superposición de la estructura cristalina del dominio subtilasa de Ssp (azul) y subtilisina BPN' (gris, PDB: 1LW644. Los residuos del sitio activo se muestran en barras rojas. Los residuos 98-109 de subtilisina BPN' que faltan en Ssp y forman el La hendidura de unión al sustrato más ancha se muestra en violeta. b Primer plano de los residuos del sitio activo con Ssp en azul y subtilisina BPN' en gris. La tríada catalítica de Ssp está marcada. c Mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc contorneado en 1σ que abarca el sitio activo de la subtilasa Ssp. d Vista de arriba hacia abajo del sitio activo de la subtilisina BPN' en complejo con el inhibidor CI2 (los residuos P5-P2' se muestran para mayor claridad). Los residuos de subtilisina BPN' 98–109 se muestran en violeta. e Superficie electrostática de la subtilisina BPN' complejada con CI2 con proteasa. Los subsitios están etiquetados en el recuadro. f Vista de arriba hacia abajo del sitio activo de Ssp. Las extensiones únicas del sitio activo de Ssp están resaltadas, a saber, extensión de horquilla β corta (E1, rosa) extensión de horquilla β larga (E3, verde) y extensión de bucle extendido con hélice α conectada (E2, naranja). El sitio activo se muestra en rojo. g Superficie electrostática del dominio de proteasa Ssp. Subsitios putativos de proteasa indicados en el recuadro. Los potenciales electrostáticos de superficie se calcularon con el complemento APBS en Pymol con potencial electrostático coloreado de negativo (rojo) a positivo (azul) con un rango de ±5 kT/e.

Construimos un mutante de Ssp dirigido al sitio, Ssp-S341A, que confirmó la serina del sitio activo previamente identificado de Ssp (29), ya que no mostró actividad contra un sustrato a base de caseína (Fig. 3c). Además, la incapacidad de Ssp-S341A para liberarse en los medios de cultivo cuando se expresa en E. coli BL21(DE3), a diferencia de la Ssp de tipo salvaje, verificó el papel del dominio subtilasa de Ssp en la mediación de su autoescisión y liberación de la superficie de la célula bacteriana. Por el contrario, cuando Ssp-S341A se expresó en E. coli Top10, se liberó en los medios de cultivo mediante escisión mediante OmpT31. Los residuos restantes del sitio activo Asp76 y His112 se identificaron a partir de la conservación de la secuencia con otras subtilasas (Figura complementaria 2) y su proximidad a la distancia de los enlaces de hidrógeno dentro de la estructura.

a Estructura cristalina de Ssp en representación de dibujos animados que muestra la ubicación de las mutaciones. b Análisis SDS-PAGE del sobrenadante del cultivo de la expresión de variantes de Ssp en E. coli Top10. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. c Actividad proteasa de variantes de Ssp utilizando un sustrato de caseína fluorescente. Las barras de error representan la desviación estándar. Las variantes de Ssp incluyen tipo salvaje (WT), eliminaciones del bucle 2 (ΔL2), eliminación de las protuberancias del sitio activo E2 y E3 (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) y mutantes dirigidos al sitio del sitio activo Ser (S314A) y motivo RGD. (RAE). pBAD denota control sólo vectorial. La media se traza con barras de error que representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

En comparación con la subtilisina BPN', la tríada catalítica se encuentra en el fondo de una hendidura profunda formada por dos horquillas β que sobresalen (E1 y E3) en un lado y un bucle extendido (E2) en el otro (Fig. 1b, c). ) que están ausentes en la subtilisina BPN '(Fig. 2a). Esta entrada distintiva al sitio activo, ubicada en la parte superior del AT, está formada por tres inserciones principales en la secuencia Ssp (Figura complementaria 2a). Además, la protuberancia del bucle extendido (E2) se conecta a una hélice α que envuelve el lado del dominio subtilasa de Ssp, otra adición única (Fig. 1c). Evaluamos el papel de las protuberancias únicas en forma de dedos E1-E3 asociadas con el sitio activo del dominio subtilasa de Ssp generando mutantes de eliminación Ssp-ΔE2, Ssp-ΔE3 y Ssp-ΔE2/E3 (Fig. 3 y Tabla complementaria 1). Se descubrió que Ssp-ΔE1 era inestable y se degradaba poco después de la secreción. Se descubrió que la eliminación del bucle E2 eliminaba casi por completo la actividad de la subtilasa, mientras que la eliminación de la hélice α que embellecía la horquilla β de E3 tenía una disminución menor en la actividad en relación con la Ssp de tipo salvaje (Fig. 3c). Estos datos respaldan el papel de los bucles que sobresalen en el reconocimiento y unión del sustrato para la función de la Ssp subtilasa.

Una comparación más detallada del sitio de unión al sustrato de Ssp y subtilisina BPN' reveló una diferencia notable entre las dos enzimas. Ssp alberga una eliminación, equivalente a los residuos 98-109 de subtilisina BPN '(Fig. 2a, d, y Fig. complementaria 2a, c), adyacente al subsitio S4 de subtilisina BPN'. Esto da como resultado una hélice α truncada y ensancha la hendidura de unión (Fig. 2f, g), lo que posiblemente permite una interfaz de unión del sustrato más extensa.

Las posibles bolsas individuales de unión a sustrato de Ssp se identificaron superponiendo la estructura de la subtilisina BPN' en complejo con el inhibidor CI2 (PDB: 1LW6)44 con el dominio subtilasa de Ssp. El bucle del sitio reactivo unido de CI2 proporcionó una guía para las posiciones de los subsitios en Ssp (Fig. 2e, g). A partir de este análisis, parece que el sitio de unión al sustrato Ssp es capaz de unir al menos cinco residuos P1 a P5 (Fig. 2g) en el lado N-terminal, no principal, del enlace escindible en comparación con cuatro residuos (P1-P4). para subtilisina BPN '(Fig. 2e). Además, las propiedades electrostáticas de la región de unión al sustrato Ssp revelaron que tiene una carga más positiva que la de la subtilisina BPN '(Fig. 2e, g). De hecho, los supuestos subsitios S1 y S5 de Ssp identificados anteriormente parecen tener una carga muy positiva, lo que sugiere que es probable que favorezca la unión de aminoácidos cargados negativamente en estas posiciones. Se sabe que Ssp se escinde en tres posiciones diferentes, lo que libera al pasajero del translocador en la superficie de la célula bacteriana (Fig. 1a)29,31. En particular, estas secuencias identificadas reconocidas por Ssp (Tabla complementaria 2), de hecho muestran una preferencia por residuos cargados negativamente en la posición P1 y P5 del sustrato, lo que se correlaciona con los supuestos subsitios S1 y S5 cargados positivamente.

El dominio de proteasa de Ssp se encuentra encima del dominio del tallo helicoidal β (Fig. 1b). Esta hélice β es un armazón común que se encuentra en la mayoría de las estructuras de AT determinadas hasta la fecha39,45,46,47,48,49,50,51. El análisis DALI43 únicamente del tallo helicoidal β de Ssp indicó que este dominio comparte una baja similitud estructural con estructuras conocidas, siendo la coincidencia más cercana el fragmento C-terminal de AT IcsA de Shigella flexneri (15% de identidad, PDB: 5KE1, Z- puntuación: 15,7) con un rmsd de 3,0 Å sobre 197 átomos de Cα.

Curiosamente, la hélice β de Ssp es la más corta vista hasta la fecha para un AT, y consta de siete giros triangulares hacia la derecha (~40 Å de longitud), con los últimos tres peldaños de la cadena β que se asemejan a un dominio de autochaperona (Figura complementaria 3). y Tabla complementaria 3), que estudios previos han demostrado que están involucrados en el plegado del pasajero AT52,53. Curiosamente, una hélice α corta en la curva 7 marca el límite entre la hélice β de la región de autochaperona (Fig. 1b).

Esta diferencia de tamaño de la hélice β es significativa en comparación con otros AT de estructura conocida que tienen hélices β entre 13 y 24 vueltas (87 a 120 Å de longitud) (Figura 1 complementaria). La hélice β de Ssp está estabilizada por una red de enlaces de hidrógeno formados entre las hebras β paralelas que forman la estructura de tres hebras y está rematada por un motivo de horquilla β C-terminal.

Hay dos bucles que se extienden desde la primera vuelta de la hélice β: bucle 1 (residuos 405–421) y bucle 2 (residuos 431–450) (Fig. 1b), y este último abarca dos hebras β antiparalelas. y un enlace disulfuro (Cys445 a Cys450). Estos bucles recuerdan a los presentes en SPATE, como los subdominios d2 y d4 de Pet, y se ha descubierto que d2 participa en la unión y la internalización en las células epiteliales54.

El tallo helicoidal β de Ssp incluye un motivo de repetición de transporte asociado a pasajeros (PATR) (residuos 464–496, Fig. 1b). Esta repetición conservada se encuentra en muchos AT y se ha demostrado que es importante en la secreción eficiente del pasajero55. Además, un motivo RGD (residuos 482–484) está incrustado en la región PATR (Fig. 1b). El motivo RGD es una secuencia de unión a integrina conocida que facilita la adhesión celular56, por lo tanto, puede estar involucrado en la función biológica de Ssp.

La caracterización estructural de Ssp reveló la presencia de tres sitios de unión a calcio, dos en el dominio subtilasa y uno en el dominio del tallo helicoidal β (Fig. 1b). El primer ion calcio se asigna a un sitio de unión de calcio común de alta afinidad (Ca-I, nomenclatura de Dohnalek et al.57), que se encuentra en muchas subtilasas como la subtilisina BPN'. En Ssp, Ca-I está coordinado por Glu45, Glu84 Asp125 y tiene contactos principales con Lys123, Ala127 y Met129 (Figura complementaria 4a). En comparación, el segundo sitio de unión al calcio (Ca-IV, nomenclatura de Dohnalek et al.57) parece ser menos común que el sitio caracterizado por primera vez en la sedolisina (formalmente conocida como PSCP), una proteasa similar a la subtilisina de la familia de proteasas S53 estructuralmente relacionada58. . La alineación estructural de Ssp y sedolisina (PDB: 1GA1) muestra que Ca-IV está coordinado por residuos similares, Asp328, Asp348, y tiene contactos de columna vertebral con Val329, Gly344 y Gly346 en sedolisina, en comparación con Asp376, Asp383, y tiene contactos de columna vertebral con Val376, Leu377 y Gly381 en Ssp (Figura complementaria 4b). El ion calcio que se encuentra en el dominio del tallo helicoidal β está coordinado por la columna vertebral de Pro529 y Gly532 desde un bucle que se extiende desde el giro 5, y Glu553 y Asp561 desde el giro 6 (Figura complementaria 4c). Juntas, estas vueltas junto con un bucle de la vuelta 7 forman una bolsa para el calcio en el extremo C de la hélice β.

Entre otras funciones, se sabe que el calcio estabiliza las estructuras de muchas enzimas42. Se descubrió que la mutagénesis dirigida al sitio de unión al calcio de la sedolisina reduce su actividad proteasa59. Para examinar la contribución del Ca2+ a la estabilización estructural de Ssp, se determinó la temperatura de fusión térmica aparente (Tmapp) de Ssp. Se encontró que Ssp es más estable en presencia de Ca2+ y es menos estable térmicamente en presencia del quelante de Ca2+ EDTA (Tabla complementaria 4), con una diferencia de 4,8 °C. Curiosamente, la presencia o ausencia de unión de Ca2+ no tuvo efecto sobre la actividad subtilasa de Ssp (Figura complementaria 5).

Se ha demostrado que varias proteasas AT, tanto de la familia SPATE como de las subtilasas, provocan el redondeo, el desprendimiento y la lisis de las células de mamíferos10,20,21,22,23,60,61, lo que puede provocar la destrucción del tejido in vivo. Las células HEp-2 (derivado de HeLa) son una de las líneas celulares más utilizadas en estos estudios9,18,55,56. Para investigar más a fondo esta función, los sobrenadantes Top10 que contenían Ssp se incubaron con monocapas de HEp-2, lo que provocó que las células se redondearan y eventualmente condujeran al desprendimiento celular (Fig. 4a). Este fenotipo no se observó en el mutante del sitio activo, Ssp-S341A. Además, los mutantes de protrusión del sitio activo de Ssp mostraron un perfil de actividad de subtilasa similar contra las células HEp-2 como se observó contra el sustrato a base de caseína (Fig. 3c) con Ssp-ΔE2 y Ssp-ΔE2/E3, que tenían ~ 5 % de actividad. contra el sustrato de caseína, lo que provocó menos redondeo celular que Ssp-ΔE3, que retuvo ~ 80% de la actividad de la proteasa (Fig. 4a). En conjunto, estos resultados demuestran que la actividad de la Ssp subtilasa provoca el redondeo y el desprendimiento de las células, y que las protuberancias en forma de dedos E2 y E3 desempeñan un papel en el reconocimiento y la unión a objetivos celulares. Curiosamente, aunque se observó redondeo celular y desprendimiento de células HEp-2, Ssp no causó lisis celular según lo determinado por la liberación de LDH, incluso cuando la proteína se incubó con células HEp-2 durante 24 h (Fig. 4b).

Se incubaron células HEp-2 con sobrenadantes de cultivo concentrados de variantes de Ssp (25 μg/ml) durante 30 minutos y se tomaron imágenes mediante microscopía DIC. La barra de escala representa 100 μm. Las variantes de Ssp incluyen el tipo salvaje (WT), la eliminación de las protuberancias del sitio activo E2 y E3 (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) y el mutante dirigido al sitio del sitio activo (S314A). pBAD denota control sólo vectorial. Se observó redondeo celular WT ~75%, pBAD ~5%, S341A ~5%, ΔE2 ~20%, ΔE3 ~50%, ΔE2/ΔE3 ~10%. b La citotoxicidad de Ssp se midió mediante incubación con células HEp-2 y se midió la liberación de LDH. La media se traza con barras de error que representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Como se sabe que varios AT, como SPATE Pet y la subtilasa AT NalP de N. meningitidis, ingresan a las células de los mamíferos para ejercer sus efectos21,62, intentamos determinar si la Ssp también es internalizada por las células HEp-2. Los 10 sobrenadantes principales que contenían Ssp se incubaron con células HEp-2, se lavaron, se permeabilizaron, se inmunotiñeron con un anticuerpo policlonal anti-Ssp y se observaron mediante microscopía confocal. Las imágenes mostraron que se encuentra Ssp en el citoplasma de las células, lo que indica que la Ssp es internalizada por las células HEp-2 (Fig. 5).

Imágenes de microscopía confocal de células HEp-2 incubadas con sobrenadantes de cultivo concentrados de variantes de Ssp (25 μg/mL) durante 5 h. La Ssp se visualizó con un anticuerpo policlonal anti-Ssp seguido del anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor Plus 647 (amarillo), el citoesqueleto de actina se tiñó con faloidina (magenta) y el núcleo se tiñó con DAPI (cian). Las variantes de Ssp incluyen tipo salvaje (WT), eliminaciones del bucle 2 (ΔL2), eliminación de las protuberancias del sitio activo E2 y E3 (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) y mutantes dirigidos al sitio del sitio activo Ser (S314A) y motivo RGD. (RAE). pBAD denota control sólo vectorial. Las imágenes son representativas de células observadas en al menos tres experimentos independientes. La barra de escala representa 50 μm.

En la hélice β de Pet, se encontró que un bucle de 57 residuos (subdominio d2) promueve la unión y la internalización de Pet en células HEp-2 y HT-2954. Por lo tanto, generamos mutantes de eliminación de Ssp que carecen del bucle 1 de hélice β (residuos 405–421, Ssp-ΔL1) y del bucle 2 (residuos 431–450, Ssp-ΔL2), además de generar sustituciones de aminoácidos en el motivo de unión a células RGD. (residuos 482–484, Ssp-RAE) que forma parte de la región PATR (Fig. 1a). Tanto Ssp-ΔL2 como Ssp-RAE se expresaron y se encontró que eran activos a un nivel comparable al de Ssp de tipo salvaje (Fig. 3b, c); sin embargo, ninguno de los mutantes de Ssp redujo su capacidad para promover el redondeo, el desprendimiento y el redondeo de las células HEp-2. e internalización (Fig. 5). Por lo tanto, a diferencia del subdominio d2 en Pet, estas características asociadas a la hélice β de Ssp no son necesarias para estos procesos. Como Ssp-ΔL1 no era estable después de la expresión, no se pudo determinar el efecto del Bucle 1 sobre el redondeo celular y la internalización mediada por Ssp.

A continuación, evaluamos el efecto de la actividad sutilasa sobre la internalización por las células HEp-2. El mutante del sitio activo, Ssp-S341A, no mostró entrada a las células epiteliales, lo que sugiere que la internalización de Ssp también depende de su actividad subtilasa (Fig. 5). Este hallazgo es contrario a la mayoría de los AT estudiados anteriormente y, por lo tanto, sugiere un modo diferente de entrada a las células por parte de Ssp, donde su función subtilasa desempeña un papel activo. También se demostró que los mutantes de protrusión del sitio activo de Ssp, Ssp-ΔE2, Ssp-ΔE3 y Ssp-ΔE2/E3, que tienen actividad de proteasa atenuada, son internalizados por las células HEp-2 (Fig. 5), lo que sugiere que incluso el 5% de la actividad de tipo salvaje es suficiente para la internalización de Ssp.

Dado que Ssp induce efectos citopáticos en las células epiteliales humanas, investigamos sus efectos in vivo. S. marcescens, como patógeno oportunista, tiene una amplia gama de huéspedes, incluidos insectos; por tanto, se probó la toxicidad in vivo de Ssp en un modelo de larvas de Galleria mellonella. Se administró Ssp-WT purificado de concentraciones variables mediante inyección intrahemocele y se controló la mortalidad de las larvas (Tabla 2). Con una dosis superior a 18,75 nmol/kg (2,5 mg/kg), se observó mortalidad y una muerte del 100 % de las larvas con las dosis más altas. Se descubrió que esta toxicidad dependía de la actividad de la Ssp subtilasa, y la Ssp inactivada con PMSF administrada a 150 nmol/kg (10 mg/kg) no causaba mortalidad. Significativamente, cuando se administró Ssp-ΔE2 purificada, que tiene ~5% de actividad en comparación con el tipo salvaje, no se observó mortalidad en todas las dosis, lo que confirma la importancia de las protuberancias únicas en forma de dedos del sitio activo en la actividad y, por lo tanto, la toxicidad de Ssp.

Aquí, presentamos la caracterización estructural y funcional de una subtilasa AT, Ssp de S. marcescens, que representa un gran grupo de subtilasa AT importantes dentro de la familia más amplia. Dentro de la familia AT extendida, Ssp es solo la tercera clase de enzimas con una estructura determinada, lo que muestra diferencias significativas con las AT proteasas y esterasas similares a (quimo)tripsina previamente determinadas40,63. Además de la variación relacionada con los diferentes dominios enzimáticos, se encontró que Ssp incorpora una hélice β, que difiere de las AT de esterasa, que no poseen una estructura de hélice β como se observa en EstA de Pseudomonas aeruginosa63. La hélice β de Ssp es la más corta determinada hasta la fecha para un AT con sólo siete vueltas. En comparación, las AT de proteasa similares a (quimo) tripsina tienen una hélice β tres veces más larga con 23 a 24 vueltas (Figura 1 complementaria). Este hallazgo contrasta con predicciones previas de que no había hélice β en las AT sutilasas33.

El dominio de subtilasa Ssp revela características únicas que no se observaron en ninguna de las más de 60 subtilasas con estructuras determinadas hasta la fecha. Además de estar unido a una hélice β de 248 residuos, las características más notables del dominio de subtilasa Ssp incluyen tres protuberancias en forma de dedos, dos de las cuales forman horquillas β, que rodean el sitio activo (Fig. 1b). Las extensiones alrededor del sitio activo de las subtilasas no son comunes y ocurren en ~13% de las subtilasas con estructuras conocidas. Aún más inusual es que dos de estas protuberancias, el bucle E2 y la horquilla β E3, son exclusivas de Ssp. Descubrimos que el bucle E2 de Ssp y la horquilla β E3 estaban involucrados en el reconocimiento/unión del sustrato. Esto es similar a la protuberancia unida por disulfuro cerca del sitio activo de AprV2 de Dichelobacter nodosus (PDB: 3LPC), que se ha demostrado mediante estudios de mutagénesis que facilita las interacciones sustrato-enzima3. Estas protuberancias contrastan marcadamente con otras características asociadas con los sitios activos de la subtilasa, como los subdominios asociados a la proteasa y los subdominios de fibronectina, mucho más grandes, que se encuentran en Streptococcus pyogenes ScpA (PDB: 3EIF)64 y la subtilasa 3 del tomate (PDB: 3I6S)65. Curiosamente, una alineación con otras AT de subtilasa (Figura 6 complementaria) ha demostrado que las inserciones, como las extensiones únicas en forma de dedos que se observan en Ssp, prevalecen, lo que sugiere que estas adiciones pueden ser una característica adoptada por las AT de subtilasa para aumentar la especificidad del sustrato y/o o reconocimiento. Otra característica notable del dominio Ssp sutilasa es una amplia hendidura de unión al sustrato, con preferencia por la unión de sustratos con sustratos cargados negativamente en las posiciones P1 y P5. Es posible que estas características aumenten la especificidad subestatal de Ssp.

Se descubrió que la actividad sutilasa de la Ssp era fundamental para la entrada en las células epiteliales humanas. De hecho, el mutante del sitio activo Ssp-S341A no tenía actividad subtilasa y no pudo ingresar a las células HEp-2, mientras que las variantes nativas y otras variantes de Ssp proteolíticamente activas, incluidas Ssp-ΔE2 y Ssp-ΔE2/ΔE3, que retuvieron algo de proteasa. actividad, se internalizaron en las condiciones experimentales, aunque estos últimos mutantes de protrusión a tasas posiblemente reducidas. Esta dependencia de la actividad de la subtilasa para la entrada de AT en células eucariotas contrasta con la subtilasa AT NalP de N. meningitidis; la única otra subtilasa AT que se muestra que ingresa directamente a las células y que lo hace independientemente de su actividad subtilasa62. El otro grupo AT que se ha demostrado que ingresa a las células eucariotas son las AT serina proteasa similares a (quimo) tripsina. Las proteínas mejor caracterizadas son las toxinas Pet de E. coli enteroagregativa (EAEC) y EspC de E. coli enteropatógena (EPEC), las cuales no requieren su actividad serina proteasa para ingresar a las células epiteliales. Pet ingresa al epitelio mediante endocitosis mediada por receptores a través de la citoqueratina-8, mientras que EspC utiliza el sistema de secreción tipo III (T3SS)66,67. Claramente, Ssp utiliza una estrategia diferente para ingresar a las células eucariotas en comparación con estos otros AT. Sin embargo, dada su colocalización con el núcleo celular (Fig. 5), Ssp puede ingresar a través de la vía endosomal para transitar a través del aparato de Golgi y el retículo endoplásmico en su camino hacia el citosol celular. La ruta de entrada de Ssp puede ser similar a la de las proteasas tipo (quimo)tripsina AT TagB, TagC y Sha recientemente investigadas de E. coli patógena extraintestinal (ExPEC), que se demostró que requieren actividad proteasa para ingresar. células humanas68.

También se encontró que la actividad de la Ssp subtilasa promueve la actividad citotóxica contra objetivos celulares. Esto se demostró mediante la adición de Ssp que provoca el redondeo celular y el desprendimiento de las células epiteliales humanas, lo que no se observó utilizando el mutante del sitio activo y, en menor medida, con los mutantes de protrusión. En conjunto, estos resultados mostraron que el grado de redondeo celular refleja la actividad proteasa relativa de la variante Ssp agregada (Figs. 4a y 5). Esto se demostró además in vivo en un modelo de G. mellonella, en el que la Ssp de tipo salvaje provocó la mortalidad de las larvas en dosis superiores a 18,75 nmol/kg (2,5 mg/kg), mientras que el PMSF inactivó la Ssp y el mutante de protrusión del sitio activo Ssp-ΔE2, que ha atenuado la actividad de la subtilasa. , no mostró mortalidad con la dosis más alta de 150 nmol/kg (10 mg/kg). La relación entre la actividad de la subtilasa AT y la citotoxicidad se demostró previamente en PfaI de P. fluorescens y Pta de P. mirabilis, donde solo la AT proteolíticamente activa resultó citotóxica para los epitelios de los peces y de la vejiga, respectivamente10,20. Además, este vínculo se ha aclarado aún más en las proteasas AT similares a (quimo)tripsina, mediante las cuales, al entrar en el epitelio, las serina proteasas de Pet y EspC digieren la fodrina asociada con el citoesqueleto celular para provocar el redondeo y el desprendimiento de las células21,22. De hecho, es posible que, además de promover la entrada celular, la Ssp subtilasa también digiera objetivos intracelulares para promover sus efectos citotóxicos, pero esto aún está por confirmar.

Se ha descubierto que el andamio de hélice β es común en todos los AT y tiene funciones en la unión de factores bacterianos y del huésped independientemente del grupo de AT. Se reveló que una extensión de bucle derivada de la hélice β de Pet denominada subdominio d2 interactúa con el receptor de citoqueratina-8 en las células epiteliales antes de la entrada66. Sin embargo, la eliminación del bucle equivalente en la hélice β de Ssp (Ssp-ΔL2) no tuvo ningún efecto observable en la entrada a las células epiteliales. En comparación, se descubrió que la hélice β de las adhesinas AT, como la E. coli UpaB uropatógena, se une directamente a las superficies celulares49. La inspección de la hélice β de Ssp reveló un motivo RGD como posible sitio de unión celular. Desafortunadamente, la alteración de este motivo no tuvo efectos perceptibles sobre la interacción de Ssp con las células epiteliales. Se descubrió que las hélices β de otras adhesinas AT, como Ag43a, estaban involucradas en la autoasociación para promover fenotipos bacterianos como la formación de biopelículas48,50. Sin embargo, es poco probable que la hélice β de Ssp tenga esta función dada su naturaleza monomérica, a juzgar por la cromatografía de exclusión por tamaño, y que no hay evidencia de agregación bacteriana mediada por Ssp (Figura complementaria 7). Además, se sabe que la Ssp no permanece en la superficie bacteriana sino que se escinde y se libera al medio ambiente por la acción de su propia subtilasa junto con otras proteasas de la superficie. En resumen, todavía tenemos que definir un papel para la inusual hélice β de Ssp.

En general, este análisis de estructura/función de la subtilasa Ssp ha proporcionado información valiosa sobre este gran grupo de AT y revela características estructurales únicas que no se comparten ni con las subtilasas ni con los autotransportadores que se requieren para su actividad citotóxica. Sin embargo, existen similitudes compartidas que también son reveladoras. El pliegue compartido entre el dominio de subtilasa Ssp y otras subtilasas sugiere un origen común. Además, la arquitectura Ssp que consiste en una proteasa N-terminal unida a una hélice β C-terminal revela un marco común observado en otros AT, como los AT proteasas similares a (quimo)tripsina. El esclarecimiento de la estructura de Ssp representa un importante paso adelante hacia la comprensión del mecanismo molecular subyacente a la divergencia funcional en la gran superfamilia AT. Por lo tanto, será de gran importancia descubrir otras características moleculares funcionalmente relevantes compartidas entre las familias más amplias de AT y enzimas, a medida que se investiguen más AT en detalle molecular.

El gen que codifica Ssp de IFO-304628 se optimizó con codones para su expresión en E. coli, se sintetizó y se subclonó en pBAD/Myc-His-B por Invitrogen. Las mutaciones en Ssp-pBAD se llevaron a cabo utilizando el método Stratagene QuikChange II con ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (NEB, M0491S) y DpnI (NEB, R0176S) o el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (NEB, E0552S). Los cebadores utilizados se detallan en la Tabla complementaria 5 y la lista de mutantes generados en la Tabla complementaria 1. Las mutaciones exitosas se verificaron mediante secuenciación de didesoxinucleótidos (Macrogen, Corea).

E. coli BL21(DE3) que alberga el plásmido Ssp-pBAD/Myc-His-B se cultivó en LB suplementado con 100 µg/ml de ampicilina a 37 °C. La expresión de Ssp se indujo mediante la adición de L-arabinosa al 0,02% a 30 °C durante 4 h. El medio se recogió, se filtró y se concentró aproximadamente 40 veces utilizando casetes de flujo cruzado Vivaflow 200 (Sartorius, VF20P2) a 4 °C antes de la diálisis en Tris 20 mM, pH 9,0. La proteína secretada se purificó mediante dos rondas de cromatografía de intercambio aniónico, HiTrap Q FF (GE Healthcare, 17515601) y Mono Q 10/100 GL (GE Healthcare, 17516701), con Tris 20 mM, pH 9,0 y elución con NaCl 1 M. La Ssp recombinante se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel utilizando un HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, 28989335) preequilibrado con HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0.

La Ssp marcada con SeMet se expresó en medios mínimos suplementados con 50 μg/ml de selenometionina induciendo con L-arabinosa al 0,5 % a 20 °C durante la noche69. Ssp-SeMet se purificó como se describe anteriormente.

Los mutantes Ssp se expresaron en células Top10 de E. coli en LB induciendo con L-arabinosa al 0,2% a 20 °C durante la noche. El medio se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo Ultra-0,5 (Amicon, UFC5010BK). La proteína se cuantificó mediante densitometría utilizando SDS-PAGE con Ssp purificada como estándar utilizando Image Lab 6.0 (Bio-Rad). Ssp-ΔE2 se purificó de la misma manera que Ssp-WT.

La actividad de la proteasa se midió usando el kit de ensayo de proteasa EnzChek, fluorescencia verde (Invitrogen, E6638) en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,005 %, pH 7,4 usando un lector de placas FLUOstar Omega (BMG Labtech) en Ex/Em 485. /520 nm. Normalmente, en el ensayo se utilizó Ssp 50 nM.

La desnaturalización térmica de Ssp se controló en un espectrofotómetro UV-Vis multicelular Agilent Cary 3500. Las fusiones térmicas se realizaron entre 20 y 90 °C y se monitorearon a 280 nm utilizando cubetas de cuarzo ultramicro de 10 mm de longitud de paso (Hellman), con una velocidad de rampa de 0,5 °C/min. Los datos se recogieron a una concentración de Ssp de 0,5 mg/ml en HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 (150 μL) con la adición de EDTA 10 mM, CaCl2 10 mM o ningún aditivo. Los datos se ajustaron a la siguiente ecuación para estimar la temperatura de fusión aparente (Tmapp):

Donde \({k=e}^{\left[\frac{h}{1.987\left(x+273.15\right.}\right]\left[\frac{x+273.15}{t+273.15}-1 \right]}\), y es absorbancia, x es temperatura, h es entalpía, t es Tmapp, u es absorbancia plegada, l es absorbancia desplegada y u1 y l1 son correcciones lineales para plegado y desplegado en función de la temperatura, respectivamente. .

Se cristalizaron Ssp, nativa y SeMet, usando el método de difusión de vapor de gota colgante con gotas que contenían 1 µL de solución de proteína (15 mg/mL en HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y 1 µL de solución de depósito (potasio 0,2 M). yoduro, 20 % (p/v) de PEG 3350, HEPES 0,1 M, pH 7,0 para Ssp nativa, y yoduro de potasio 0,2 M, 23 % (p/v) de PEG 3350, HEPES 0,1 M, pH 6,8 para Ssp-SeMet) a 20 ºC. Los cristales aparecieron en 5 días. Para la recopilación de datos de rayos X, los cristales de Ssp se empaparon en una solución crioprotectora que contenía una solución de depósito compuesta de glicerol (20 % v/v) y se enfriaron instantáneamente directamente en nitrógeno líquido. Tanto los datos nativos como los anómalos se recopilaron en 360° utilizando 0,954 Å a 100 K con un detector EIGER x 16 M con 0,1 grados por cuadro con 0,02 s de exposición en el sincrotrón australiano en el MX2 Beamline70. Los datos fueron indexados e integrados utilizando XDS71. Los datos nativos se escalaron usando AIMLESS72 a una resolución de 2,0 Å, pertenecientes al grupo espacial P1 con dimensiones de celda de a = 47,48 Å, b = 55,36 Å, c = 61,88 Å y α = 91,52°, β = 93,04° y γ = 102,76° . Esto era consistente con una molécula en la unidad asimétrica. Los datos anómalos de los cristales de SeMet se analizaron utilizando BLEND73 para celdas unitarias isomorfas, mediante las cuales se fusionaron dos conjuntos de datos utilizando POINTLESS y AIMLESS72. Consulte la Tabla 1 para conocer todas las estadísticas de recopilación y procesamiento de datos.

La estructura de Ssp se resolvió utilizando una combinación del método SIRAS y el protocolo de fase MRSAD en la plataforma automatizada de determinación de la estructura cristalina Auto-Rickshaw74. Los valores de FA se calcularon utilizando el programa SHELXC75 con el conjunto de datos SeMet nativo y combinado combinando señales isomorfas y anómalas. Se encontró un total de nueve átomos de selenio por unidad asimétrica utilizando SHELXD76. Después del refinamiento atómico y la modificación de la densidad, se generó un modelo inicial usando el programa BUCCANEER77 con refinamiento SAD, y luego se mejoró usando el protocolo de fases MRSAD de Auto-Rickshaw74,78. El modelo resultante se perfeccionó con el conjunto de datos nativo utilizando REFMAC579 y se construyó adicionalmente utilizando COOT80. MolProbity81 evaluó la calidad del modelo Ssp. Las estadísticas de Ramachandran mostraron el 97% de los residuos en la región más favorecida y el 3% en las regiones permitidas. Los valores de refinamiento se dan en la Tabla 1. Las figuras moleculares se generaron usando PyMOL82. El código de identificación de PDB es 8E7F.

La albúmina sérica bovina (BSA) se adquirió de Scientifix (BSAS-0.1). HEp-2 fue donado amablemente por la Dra. Natalie Borg (RMIT, Australia). HEp-2 es un conocido contaminante del carcinoma HeLa humano. Es una línea celular ampliamente utilizada en la investigación de autotransportadores y, como tal, decidimos utilizar la línea celular y mantener la referencia a HEp-2 en el artículo para mantener la coherencia. La línea celular no fue autenticada. Las células HEp-2 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, 11965092) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Corning, 35-076-CV) y l-Gln 2 mM (Gibco, 25030081). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 y se recolectaron usando tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco, 25200056). Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2, a menos que se especifique lo contrario. Las proteínas y los medios concentrados se filtraron de forma estéril con filtros de tubo de centrífuga Costar Spin-X (Corning, 8161) antes de aplicarlos a las células.

Se sembraron células HEp-2 a una densidad de 2000 células/pocillo en placas de 96 pocillos (Falcon, 353072) en DMEM, FBS al 5 % y l-Gln 2 mM. Las células se trataron con Ssp durante 5 ho 24 h. Se utilizó el ensayo de citotoxicidad CyQUANT LDH (Invitrogen, C20301) para determinar la actividad de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La inmunodetección de Ssp se llevó a cabo utilizando suero policlonal de conejo purificado cultivado contra un pasajero purificado de Ssp en Walter and Eliza Hall Antibody Facility (Australia). Se sembraron células HEp-2 a una densidad de 2,0 x 105 células/pocillo en cubreobjetos de 18 mm (Marienfeld, 0117580) en placas de 12 pocillos (Greiner, 665180) para microscopía confocal o 1,0 x 105 células/pocillo en placas de 24 pocillos (Greiner , 662160) para microscopía DIC en DMEM, FBS al 10% y l-Gln 2 mM. Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el medio se cambió a RPMI 1640 (Gibco, 11875093).

La microscopía confocal comenzó con 25 μg/mL de sobrenadantes concentrados de variantes de Ssp agregados por pocillo y las células se incubaron durante 5 h antes de lavar con PBS (esta concentración se basa en las concentraciones utilizadas previamente para la caracterización de autotransportadores citotóxicos (30–37 μg/mL). mL)23,66 así como la concentración de sobrenadante de Ssp previamente detectada por SDS-PAGE en el nematicida Serratia sp.27). Para las preparaciones de portaobjetos, todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente y los lavados se realizaron después de cada paso con PBS-T (PBS con Tween-20 al 0,05%) a menos que se especifique. Las células se fijaron con formalina al 4%/PBS durante 10 minutos antes de lavar con PBS con glicina 100 mM. Las células fijadas se permeabilizaron con Triton X-100/PBS al 0,2% durante 5 minutos y se bloquearon con BSA/PBS al 2% durante 1 hora o durante la noche a 4 °C. Luego, los cubreobjetos se incubaron con antisueros policlonales Ssp (1:4) durante 1,25 h, anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado Alexa Fluor Plus 647 (1:200, Invitrogen, A32733) durante 1 h, reactivo Phaloidin-iFluor 555 (1:4): 1000, Abcam, ab176756) durante 30 min y DAPI (1 μg/mL, Sigma, D9542) durante 5 min en la oscuridad. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos con SlowFade Diamond Antifade Mountant (Invitrogen, S36972) y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Zeiss LSM 780 con un aumento de 40 ×. Para el canal anti-Ssp, se tomó una pila Z que consta de 10 cortes desde la parte superior a la inferior de las celdas y la pila Z se proyectó utilizando la función de suma en FIJI83. Las imágenes se procesaron en FIJI83 utilizando el complemento BIOP Channel Tools.

La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) comenzó con sobrenadantes concentrados de variantes de Ssp (12,5 μg, 25 μg/mL) agregados por pocillo y las células se incubaron durante 30 minutos antes de lavar con PBS. Se tomaron imágenes de las células utilizando el microscopio Zeiss Axio Observer con un aumento de 10 ×. Las imágenes fueron procesadas en FIJI83.

Se criaron larvas de Galleria mellonella a 19 °C en una incubadora refrigerada (TRIL-495-1-SD, Thermoline Scientific) con una dieta de 46 % (p/p) de cereal multigrano Farex (6 meses+, Heinz), 22 % (p/p) w) glicerol (Chem-Supply), 22% (p/p) de miel (Capilano), 7% (p/p) de agua desionizada y 3% (p/p) de extracto de levadura (Oxoid, LP0021B).

A grupos de seis larvas (masa promedio de 165 mg) seleccionadas al azar, se les inyectaron 20 µL de variante Ssp purificada diluida en PBS estéril a través de la última pierna pro derecha usando una jeringa de insulina U-100 de 1 ml (Terumo, 29 G × 13 mm) acoplado a una bomba de jeringa NE-1000 (New Era). Las larvas inoculadas se incubaron a 37 °C y se evaluó la mortalidad diariamente. Las larvas se consideraron muertas si no se observaba respuesta tras un estímulo físico con pinzas.

El control del vector Ssp-pBAD o pBAD en E. coli Top10 se cultivó en LB con ampicilina 100 µg/ml a 37 °C con agitación. La expresión de Ssp se indujo mediante la adición de L-arabinosa al 0,2% a 20 °C durante la noche. El cultivo (800 µl) se añadió a cubetas semimicro (Greiner) y se midió la DO600 durante horas extras a temperatura ambiente (Molecular Devices SpectraMax M5).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La cristalografía, las coordenadas atómicas y los factores estructurales informados en este artículo se han depositado en el Protein Data Bank, con el PDB ID 8E7F. En este estudio también se utilizaron los siguientes modelos estructurales del PDB: 1LW6 (subtilisina BPN'), 5KE1 (autotransportador de IcsA), 1GA1 (sedolisina), 3LPC (AprV2 de Dichelobacter nodosus), 3EIF (Streptococcus pyogenes ScpA) y 3I6S (tomate). sutilasa). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de luz MX2 en el sincrotrón australiano, parte de ANSTO, y utilizó el detector de la Fundación Australiana para la Investigación del Cáncer (ACRF). Los autores desean agradecer a Peter Lock y Chad Johnson de la Plataforma de Bioimagen de la Universidad La Trobe. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del proyecto del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (DP150102287, DP180102987, DP210100673), la beca (FT130100580) y una subvención del proyecto del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC) (GNT1143638).

Departamento de Bioquímica y Química, Instituto La Trobe de Ciencias Moleculares, Universidad La Trobe, Kingsbury Drive, Bundoora, VIC, 3086, Australia

Lillian Hor, Pilar de Aquila, James A. McKenna, Marilyn A. Anderson, Jason J. Paxman y Begoña Heras

Sincrotrón australiano, ANSTO, Clayton, VIC, 3168, Australia

Santosh Panjikar

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Monash, Clayton, VIC, 3800, Australia

Santosh Panjikar

INRAE, Universidad de Clermont Auvernia, UMR454 MEDiS, 63000, Clermont-Ferrand, Francia

Mickaël Desvaux

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BH, JJP y MD diseñaron la investigación. LH, AP y SP realizaron los experimentos. BH, JJP, LH y SP analizaron los datos. BH, JJP, JAM y MAD supervisaron aspectos del trabajo. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los resultados. LH, JJP y BH escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión crítica del manuscrito, leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jason J. Paxman o Begoña Heras.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Peter van Ulsen y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Hor, L., Pilapitiya, A., McKenna, JA et al. La estructura cristalina de un dominio de pasajeros de un autotransportador similar a la subtilisina revela información sobre su función citotóxica. Nat Comuna 14, 1163 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36719-2

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Recibido: 05 de octubre de 2022

Aceptado: 14 de febrero de 2023

Publicado: 01 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36719-2

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