Malezas comunes como bioindicadores de metales pesados: un nuevo enfoque en biomonitoreo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6926 (2023) Citar este artículo

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La contaminación ambiental por metales pesados afecta tanto a zonas urbanas como no urbanas de Europa y del mundo. El uso de plantas bioindicadoras para la detección de estos contaminantes es una práctica común. Una propiedad importante de los bioindicadores potenciales es su fácil disponibilidad y su amplio rango de distribución, lo que significa que pueden utilizarse prácticamente en una amplia zona. Por lo tanto, las malezas comunes y de amplia distribución: Trifolium pratense L., Rumex acetosa L., Amaranthus retroflexus L., Plantago lanceolata L., las especies ornamentales Alcea rosea L. y Lolium multiflorum L. var. Ponto fueron seleccionados como potenciales bioindicadores de metales pesados (Cd, Pb, Cu, Zn). Se expusieron plantas en las mismas condiciones de suelo en tres sitios de muestra en la ciudad de Poznań. Se encontró que todas las especies tenían potencial de acumulación de metales pesados, especialmente A. rosea, P. lanceolata y L. multiflorum para Zn (BCF = 6,62; 5,17; 4,70) y A. rosea, P. lanceolata para Cd (BCF = 8,51; 6.94). La translocación de Cu y Zn fue la más efectiva en T. pratense (TFCu = 2,55; TFZn = 2,67) y en A. retroflexus (TFCu = 1,50; TFZn = 2,23). La translocación de Cd fue la más eficiente en T. pratense (TFCd = 1,97), pero la PB fue la más efectiva en A. retroflexus (TFPb = 3,09). Con base en la respuesta fisiológica al estrés, se detectó un nivel creciente de peróxido de hidrógeno. (H2O2) en raíces y hojas de todas las muestras, siendo la más alta en todos los órganos de A. rosea. Los niveles de actividad enzimática de CAT, APOX y también el marcador de peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados MDA fueron mayores después de 6 semanas de exposición en comparación con las muestras de control y variaron en el tiempo de exposición y entre especies y exposición. Después del experimento, en casi todas las muestras detectamos una reducción del contenido de clorofila y del contenido relativo de agua, pero en la eficiencia de los parámetros de la fotosíntesis: tasa neta de fotosíntesis, concentración de CO2 intercelular y conductancia estomática, notamos valores aumentados, lo que demostró el estado relativamente bueno de Las plantas. Las malezas examinadas son buenos bioindicadores de contaminación por metales pesados y su uso combinado permite una detección integral de amenazas ambientales.

Con el desarrollo intensivo de las actividades humanas, las zonas urbanas han experimentado rápidamente cambios importantes y rápidos. En las zonas urbanas, uno de los contaminantes urbanos más importantes son los metales y metaloides1, 2. Los metales y metaloides son objeto de numerosos estudios porque son persistentes y se encuentran entre los contaminantes industriales más ampliamente difundidos3. Las principales fuentes de estos elementos son fuentes naturales, como la erosión natural de la corteza terrestre, la erosión y las actividades antropogénicas, como la escorrentía urbana, las actividades agrícolas e industriales, y muchas otras4. La exposición a metales pesados suele tener síntomas sutiles y crónicos; además, la exposición a metales en el aire induce respuestas fisiológicas en los organismos y amplios efectos sobre la salud de los seres humanos5. Además, se sabe que la contaminación de sustancias dietéticas por metales pesados tiene una variedad de efectos adversos en humanos, animales y plantas6, 7. En las plantas, su toxicidad varía según el metal específico, las especies de plantas, el pH, la composición del suelo y las sustancias químicas. forma. Ciertos metales pesados se consideran esenciales para el desarrollo y crecimiento de las plantas8. Sin embargo, cantidades excesivas de estos elementos pueden volverse tóxicas para las plantas9, afectando así sólo negativamente a las plantas10.

La exposición de las plantas a condiciones ambientales desfavorables, incluidas concentraciones más altas de metales pesados, puede provocar un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), como el oxígeno singlete [(1) O2], superóxido [(O2)-.) ], peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH.). Las ROS modifican las proteínas, dañan el ADN y provocan la oxidación por radicales libres de ácidos grasos insaturados u otros lípidos cuyo producto es la MDA. El proceso de desintoxicación de ROS en las plantas es esencial para la protección de las células vegetales, por lo que parece que las plantas hiperacumuladoras de metales deberían tener mecanismos de defensa antioxidantes y detoxicantes extremadamente eficientes, que les permitan crecer y desarrollarse en un ambiente contaminado11. Las respuestas de las plantas y la tolerancia al estrés por metales pesados dependen de antioxidantes enzimáticos que comprenden ascorbato peroxidasa (APOX), catalasa (CAT) y el producto final de la peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados: malondialdehído (MDA). Estas proteínas participan en la detoxificación de ROS en las plantas12, y están presentes en prácticamente todos los compartimentos subcelulares. Por lo general, un orgánulo tiene más de una enzima capaz de eliminar un solo ROS13. Como resultado del estrés oxidativo, se alteran los procesos fotosintéticos, desde el transporte de electrones hasta los enlaces de carbono. La limitación de cualquiera de estos procesos dentro del aparato fotosintético reduce la capacidad de la membrana del cloroplasto para absorber energía luminosa, aumentando la capacidad de formar radicales oxidativos en el cloroplasto y, como consecuencia, limita la productividad de la fotosíntesis14.

Es necesario identificar áreas con mayores concentraciones de metales pesados, directrices y legislación efectiva. Además, estos metales deberían estar sujetos a un seguimiento obligatorio debido a su toxicidad y posible bioacumulación4. Controlar los contaminantes es una cuestión compleja: se debe identificar el origen de los contaminantes y de las emisiones, se deben controlar las emisiones críticas, se deben desarrollar técnicas que sean lo suficientemente sensibles y de bajo costo para permitir la medición simultánea de múltiples contaminantes, se deben analizar los riesgos y los factores económicos. considerado15. Un método sencillo y económico para determinar la concentración de metales pesados en el aire y obtener información asociada a la exposición de la población a contaminantes atmosféricos en un ecosistema particular es el biomonitoreo16. Además, para obtener información sobre los cambios en los ecosistemas se pueden utilizar bioindicadores. Algunas plantas son bien conocidas por su capacidad para acumular oligoelementos del medio ambiente. Por lo tanto, se han utilizado en numerosas investigaciones de seguimiento, proporcionando información de bajo coste sobre la calidad ambiental con la ventaja de un muestreo sencillo. Diversos estudios han utilizado como bioindicadores plantas herbáceas (p. ej., Taraxacum officinale, L., Carduus nutans L., Plantago major L., Urtica dioica L.), que son más comunes en ambientes urbanos (p. ej.17,18,19,20).

Estudios anteriores han indicado la capacidad de especies seleccionadas para bioacumular metales pesados. Sin embargo, hasta el momento no se han estudiado simultáneamente, en las mismas condiciones de contaminación, además de tener en cuenta la respuesta fisiológica. El control de la contaminación por elementos tóxicos con el uso simultáneo de malezas comúnmente disponibles como Plantago lanceolata L.21, Amaranthus retroflexus L.22, Trifolium pratense L.1, Rumex acetosa23 y también conocida por su capacidad de acumulación de trazas de metales, antigua planta ornamental ( Alcea rosea)24, parece ser un procedimiento necesario que permite una estimación integral de la contaminación ambiental por metales traza. Las malezas seleccionadas tienen las características básicas de los bioindicadores, tales como: ciclo de vida largo, amplios rangos geográficos, gran número de ocurrencia y facilidad de determinación. Nuestra investigación se centró en comprobar si las especies de malas hierbas seleccionadas reaccionan de forma característica a los cambios en el medio ambiente (reacción al estrés físico y químico) según el lugar de aparición. Realizamos estos arreglos utilizando la bioindicación activa basada en la exposición y observación de especies vegetales específicas. Aquí es donde radica el propósito de nuestra investigación: evaluar bioindicadores muy comunes y generalizados.

Considerando lo anterior, los principales objetivos de este estudio fueron los siguientes: (i) determinar el nivel de acumulación de metales traza (Cu, Zn, Cd y Pb) en especies de plantas seleccionadas expuestas en condiciones uniformes de suelo en tres sitios de investigación de la ciudad ; (ii) evaluar el potencial de bioacumulación de las especies examinadas; (iii) establecer la translocación de metales del suelo a las partes aéreas; (iv) estudiar las condiciones fisiológicas de las plantas; (v) determinar la actividad de los parámetros del estrés oxidativo; y (vi) evaluar las concentraciones de enzimas del sistema antioxidante.

Se examinó el contenido de cobre, zinc, cadmio y plomo en el suelo utilizado para el cultivo en macetas y en los tejidos (raíces y hojas) de todas las muestras de las especies estudiadas, y luego se calcularon los factores de bioconcentración y translocación con base en estos resultados para evaluar potencial de bioacumulación de las especies examinadas. Además, se detectaron las respuestas fisiológicas de las plantas al estrés en todas las muestras de especies examinadas.

Los contenidos de metales pesados para todas las especies en todos los sitios de investigación mostraron la siguiente tendencia: Zn > Cu > Pb > Cd. Esta tendencia se encontró para el suelo y los órganos de las plantas (raíces y hojas). Además, para el zinc y el cadmio, los valores más bajos se observaron principalmente en el suelo, mientras que para el cobre y el plomo su contenido fue generalmente el más alto en el suelo, con solo unas pocas excepciones (Tabla complementaria S1). Analizando los datos con más detalle, se encontró que las concentraciones de Cu, Zn, Cd y Pb en raíces y hojas difieren en todas las especies. La mayor concentración de Cu en raíces se encontró en T. pratense (2C: 20.38 mg kg−1); también se registró un valor alto en R. acetosa (3C: 10,51 mg kg−1) y en L. multiflorum (1B: 8,30 mg kg−1). La mayor acumulación de Cu en hojas se detectó en R. acetosa (3C: 9,66 mg kg-1), en T. pratense (2B: 9,20 mg kg-1) y en A. rosea (4B: 8,13 mg kg-1). La mayor concentración de Zn en raíces se detectó en L. multiflorum (1C: 81,13 mg kg−1), P. lanceolata (6C: 80,45 mg kg−1), T. pratense (2C: 68,49 mg kg−1), A. rosea (4B: 55,73 mg kg-1) y A. retroflexus (5A: 52,62 mg kg-1). En las hojas de L. multiflorum se registró la mayor concentración de Zn (1B: 172,45 mg kg−1); También se encontró alta concentración de Zn en hojas de A. rosea (4A: 135,85 mg kg-1) y P. lanceolata (6C: 114,77 mg kg-1). En las muestras de suelo la concentración de Zn fue menor que en los tejidos vegetales. La cantidad de Cd varió en raíces y hojas de las especies estudiadas. En raíces de P. lanceolata (Testigo: 0.69 mg kg−1) encontramos la mayor concentración de Cd; También se encontró una alta concentración de Cd en las raíces de A. rosea (4A y 4B: 0,58 mg kg-1). En hojas de A. rosea (4B: 1,24 mg kg−1) observamos la mayor cantidad de Cd; también en hojas de L. multiflorum (1C: 0,79 mg kg−1) y en P. lanceolata (6A: 1,11 mg kg−1) se detectó alta concentración de Cd en hojas. La mayor cantidad de Pb se encontró en raíces de L. multiflorum (1C: 1,32 mg kg-1), así como una alta concentración de Pb en raíces de R. acetosa (3C: 0,75 mg kg-1). En tejido foliar de L. multiflorum se detectó la mayor concentración de Pb (1A: 1,21 mg kg−1), en R. acetosa la concentración de Pb en hojas alcanzó 0,99 mg kg−1 y en P. lanceolata alcanzó 0,77 mg kg−1. . La concentración de Pb en las muestras de suelo fue mayor que en las plantas. Sin embargo, el ANOVA bidireccional de especies y el efecto del sitio revelaron una influencia significativa (α ≤ 0,05) de ambos factores en todos los niveles de oligoelementos analizados en raíces y hojas. Se encontró que ambos factores no tenían un efecto significativo en los niveles analizados de estos elementos en el suelo, excepto el cadmio (una observación atípica en el control) (Tabla complementaria S2).

Con base en el análisis de conglomerados con el procedimiento de agrupación de objetos y características (Fig. 1), tomando en cuenta todos los metales pesados detectados, se puede encontrar que existieron diferencias entre las muestras de los sitios A, B y C. El suelo más contaminado por Pb, Cu, Zn y Cd procedían del sitio B: el Jardín Botánico. Se formaron dos grupos de muestras. El primero estaba formado por 1B, 1C, 4A y 4B, y 6C. El segundo estuvo formado por cuatro subgrupos: el primer subgrupo incluyó las muestras 6B, 2B, 6A y 1A; el segundo 5A, 2C; el tercero 3C, 4C, 5C; y el cuarto 3A, 2A, 3B, 5B. En cuanto a los valores de metales pesados en raíces de las especies detectadas, la mayor concentración de Zn en raíces se detectó en L. multiflorum (1B, 1C, 1A), A. rosea (4A, 4B) y en P. lanceolata (6A, 6C). ); los valores más altos de Cd en raíces se detectaron en muestras de A. rosea (4A, 4B), L. multiflorum (1C) y P. lanceolata (6A); la mayor concentración de Pb en raíces se observó en L. multiflorum (1B, 1C, 1A), P. lanceolata (6B), R. acetosa (3C), A. rosea (4C), A. retroflexus (5C) y en T. pratense (2A). En secuencia, considerando el Cu en raíces, observamos los valores más altos en R. acetosa (3C, 3A y 3B), T. pratense (2B, 2C), A. rosea (4B) y P. lanceolata (6A). En cuanto a los valores de metales pesados en hojas de las especies detectadas, las mayores concentraciones de Zn se observaron en L. multiflorum (1C), P. lanceolata (6C y 3C), A. rosea (4B), A. retroflexus (5A), y T. pratense (2C), mientras que las mayores cantidades de Cd se detectaron en hojas de las siguientes muestras: P. lanceolata (6B, 6C), A. rosea (4A, 4B, 4C), T. pratense (2C), y A. retroflexus (5C). Se detectaron valores relativamente altos de Pb en hojas en L. multiflorum (1C, 1A), T. pratense (2B), R. acetosa (3C, 3A) y A. retroflexus (5B), y finalmente, las mayores concentraciones de Cu. en hojas se detectaron en las siguientes muestras: T. pratense (2C) y R. acetosa en (3C).

Mapa de calor y análisis de conglomerados de contenidos de metales pesados en suelos, raíces y hojas en muestras examinadas en todos los sitios de investigación (para abreviaturas, ver “Materiales y métodos”).

Los factores de bioconcentración (FBC) superaron el valor 1 para Zn y Cd en todas las especies vegetales. Los valores más altos de Zn BCF se registraron en L. multiflorum (1C: BCFZn = 6.62), en A. rosea (4A: BCFZn = 5.17) y en P. lanceolata (6C: BCFZn = 4.70); sin embargo, los valores más altos de Cd BCF se encontraron en A. rosea (4B: BCFCd = 8.51), en P. lanceolata (6A: BCFCd = 6.94) y en 1C L. multiflorum (BCFCd = 6.29). La bioconcentración de Cu y Pb no fue tan efectiva como la de los dos primeros elementos, pero vale la pena mencionar que los factores de bioconcentración de Cu de todas las muestras detectadas exceden la bioconcentración de Pb. Teniendo en cuenta la translocación de los HM detectados, el valor más alto de Cu TF se detectó en la muestra 2C de T. pratense (TFCu = 2,55), en la muestra 6C de P. lanceolata (TFCu = 1,55), en la muestra 5A de A. retroflexus (TFCu = 1,50), y en todas las muestras de Lolium multiflorum (TFCu = 1,31–1,08). El factor de translocación de Zn fue el más alto en T. pratense 2C (TFZn = 2,67), en todas las muestras de A. retroflexus (TFZn = 2,23–1,05) y en R. acetosa (TFZn = 1,28–1,11). El factor de translocación de Cd más alto se detectó en 2C T. pratense (TFCd = 1,97), seguido de P. lanceolata (TFCd = 1,51–1,24) y en R. acetosa (TFCd = 1,44–1,42). En cuanto al factor de translocación de Pb, los valores más altos se detectaron en A. retroflexus (TFPb = 3.09), en P. lanceolata en 6B (TFPb = 2.25) y en la muestra 4A de A. rosea (TFPb = 1.90) (Cuadro 1) .

Después de 6 semanas del experimento, la estabilidad de la membrana celular (MSI) tomó valores desde 93,41% en la muestra 4C de Alcea rosea hasta los valores más altos, más del 98%, en todas las muestras de Plantago lanceolata, y en muestras de Trifolium pratense, Rumex acetosa y Amaranthus. retroflexo. El contenido de masa seca fue mayor (23,11%) en la muestra 5A de Amaranthus retroflexus, y el más bajo en R. acetosa (8,01%) en la muestra 3C. En todas las especies se detectaron contenidos de masa seca superiores en comparación con las muestras de control. El RWC fue el más alto en la muestra 3A de R. acetosa (95,25%) y el más bajo en la muestra 4C de A. rosea (62,53%). Cabe señalar que casi todas las muestras se caracterizaron por un RWC superior al 90%. El contenido de clorofila a osciló entre 3,33 en Amaranthus retroflexus y 11,02 en Rumex acetosa. El contenido de clorofila b osciló entre 4,96 en Trifolium pratense y 0,9 en Amaranthus retroflexus. El contenido de clorofila a + b osciló entre 4,11 en A. retroflexus y 15,36 en R. acetosa. La relación clorofila a/b osciló entre 0,27 en A. retroflexus y 0,58 en T. pratense. La actividad de la fotosíntesis (PN) varió en las especies detectadas desde 7,24 en Rumex acetosa hasta 28,28 en la muestra de Trifolium pratense. La conductancia estomática (gs) osciló entre 32,64 en Amaranthus retroflexus y 188,86 en Trifolium pratense. La concentración de CO2 intercelular de Ci varía de 261,47 en Amaranthus retroflexus a 528,20 en Plantago lanceolata (Tabla 2).

La representación gráfica de los resultados mediante análisis de los dos primeros componentes principales para la acumulación de metales pesados en hojas, raíces y parámetros de actividad fotosintética en todas las muestras explicó más del 47,81% de la variabilidad total (Fig. 2). Se encontró una relación positiva entre Zn-BCF, Cd-BCF en muestras de L. multiflorum (1A, 1B, 1C), T. pratense (2B) y en muestras de A. rosea (4B, 4C). También encontramos una relación positiva entre Pb TF y el contenido de masa seca en P. lanceolata (6B). Otro gran grupo consiste en Zn TF, Cu-TF, Cd TF correlacionados con el contenido relativo de agua (RWC), la estabilidad de la membrana celular (MSI), el coeficiente de clorofila b/a y la tasa fotosintética neta – PN. de muestras de T. pratense (2A, 2C), R. acetosa (3A, 3B) y A. retroflexus (5C). El último grupo estuvo compuesto por Pb-BCF, Cu-BF correlacionados con la conductancia estomática del contenido de clorofila (gs) y la concentración de CO2 intercelular (Ci) de muestras de R. acetosa (3C) y P. lanceolata (6A, 6C).

Análisis de componentes principales de concentraciones de metales pesados, factor de bioconcentración (BCF) y factor de translocación (TF) en muestras examinadas (abreviaturas ver “Materiales y métodos”) en relación con los parámetros de actividad de la fotosíntesis: tasa fotosintética neta PN, conductancia estomática gs y concentración de CO2 intercelular y (Ci), parámetros de clorofila y masa seca, contenido relativo de agua (RWC) y estabilidad de la membrana celular (MSI).

Los perfiles de cambios y el nivel de valores de peróxido de hidrógeno en todas las especies fueron similares en raíces y hojas, con la mayor cantidad de H2O2 ≈ 6 (nmol H2O2 × min−1 × mg proteína−1) en raíces de R. acetosa y A. rosa (4A). La cantidad más alta de H2O2 ≈ 5 (nmol H2O2 × min-1 × mg de proteína-1) en las hojas se detectó en todas las muestras de T. pratense, A. retroflexus y en la muestra 4A de A. rosea (Fig. S1).

Los perfiles de cambios y el nivel de actividad CAT fueron similares en raíces y hojas de L. multiflorum, R. acetosa y A. retroflexus. La mayor actividad de CAT ≈ 1,5 (nmol H2O2 × min-1 × mg proteína-1) en raíces y CAT ≈ 0,9 (nmol H2O2 × min-1 × mg proteína-1) en hojas se observó en L. multiflorum. Vale la pena señalar que en A. retroflexus y en P. lanceolata se observó una alta actividad de CAT ≈ 0,9 (nmol H2O2 × min-1 × mg proteína-1) en las raíces. En las hojas, la mayor actividad se observó en L. multiflorum CAT ≈ 0,9 (nmol H2O2 × min-1 × mg proteína-1) y en A. retroflexus CAT ≈ 0,55 (nmol H2O2 × min-1 × mg proteína-1) (Fig. .S2).

Las actividades de APOX fueron generalmente mayores en las raíces que en las hojas. En raíces, la mayor actividad (APOX ≈ 0.065) se observó en L. multiflorum y en P. lanceolata. En las hojas, la actividad de APOX en todas las muestras fue alta, con la mayor actividad de APOX ≈ 0,03 en L. multiflorum y en la muestra de A. rosea (Fig. S3).

Los perfiles de cambios y el nivel de actividad de MDA fueron mayores en raíces que en hojas de T. pratense, R. acetosa, A. rosea y A. retroflexus. El nivel más alto de MDA ≈ 12,0 en raíces y hojas (MDA ≈ 7,0) se detectó en la muestra 4A de A. rosea (Fig. S4).

La representación gráfica de los resultados mediante el análisis de los dos primeros componentes principales para la acumulación de metales pesados en hojas, raíces y los parámetros de actividad de la fotosíntesis en todas las muestras explicó más del 45% de la variabilidad total (Fig. 3). Se encontró una relación positiva entre la actividad CAT en hojas y Cd y Cu en raíces de Plantago lanceolata muestras 6A y 6B y Alcea rosea muestra 4B. Las actividades de APOX en las raíces se relacionaron con el Zn en las raíces de la muestra 4A de Alcea rosea. Hubo una relación positiva entre la cantidad de peróxido de hidrógeno y Cu y Zn en hojas de Plantago lanceolata muestra 6C. El siguiente grupo estuvo formado por APOX en hojas, contenido de MDA en raíces y el nivel de Pb en raíces y hojas, el nivel de Cu en hojas en muestras de A. rosea 4C, R. acetosa 3C, A. retroflexus 5C y T. pratense 2C. . Finalmente, hubo relación entre el peróxido de hidrógeno en hojas, la actividad CAT en raíces en muestras de A. retroflexus 5A y B, R. acetosa 3A y T. pratense 2A y B.

Análisis de componentes principales de la concentración de metales pesados en muestras examinadas (para abreviaturas, consulte "Materiales y métodos") en relación con las actividades de peróxido de hidrógeno: H2O2, APOX, CAT, MDA.

La fluorescencia DHE más intensa, que indica la presencia de H2O2 en las hojas, se observó en las muestras de T. pratense (2A), Rumex acetosa (3A), A. rosea (4A) y P. lanceolata (6A) (Fig. 4). .

Las imágenes fluorescentes muestran la producción de H2O2 en las hojas de las especies examinadas después de la exposición (para abreviaturas, ver “Materiales y métodos”). La barra indica 1 µm.

Este estudio comparativo de diferentes especies de malezas ha demostrado su potencial para la acumulación de HM. Lolium multiflorum var. Ponto se utilizó como una variedad conocida que acumula HM19, 25, 26, pero en nuestro estudio se encontró que esta variedad mostraba posibilidades similares de acumulación de HM a las especies de malezas seleccionadas para el experimento. Casi todas las especies estudiadas mostraron un potencial significativo para la acumulación de Zn y Cd en comparación con Cu y Pb. La eficiencia de acumulación se expresó como el factor BCF y la eficiencia de desplazamiento del metal como el factor de translocación (TF). Para una planta hiperacumuladora, ambos factores deberían ser mayores que la unidad27. Teniendo en cuenta estos dos factores, se puede seleccionar el bioindicador más eficaz. Analizando el cadmio, que es el metal más tóxico para plantas y animales28, el mayor contenido de Cd se encontró en las raíces de A. rosea y P. lanceolata. Los coeficientes de bioconcentración muy altos calculados para estas dos especies confirmaron el potencial de que este elemento se concentre en los tejidos de estas especies. La utilidad de A. rosea como hiperacumulador de Cd fue señalada previamente por Liu et al.29 y Ubeynarayana et al.30. El Zn también se acumuló eficazmente principalmente en las hojas de A. rosea y P. lanceolata. Sin embargo, vale la pena señalar que todas las especies analizadas acumularon bien Zn. Esta capacidad también fue confirmada por factores de bioconcentración determinados para esta especie. El zinc, como micronutriente esencial en la nutrición de las plantas, es absorbido naturalmente por las plantas y la eficiencia de la absorción depende del pH del suelo y de los niveles de fósforo. En los países de la Unión Europea, el suelo está contaminado con zinc, debido al uso de lodos de depuradora con fines de fertilización o a compost elaborado a partir de ellos31. Las cantidades de Zn en suelos no contaminados suelen ser inferiores a 125 ppm (125 mg kg-1) y en las plantas que crecen en estos suelos esta concentración de metal varía entre 0,02 y 0,04 mg g-1 (20-40 mg kg-1) de peso seco32 . En nuestro estudio, la mayor concentración de Zn (≈ 29 mg/kg) se detectó en el suelo del Jardín Botánico (B), lo que podría ser consecuencia del uso de fertilizantes en esta zona. Sin embargo, de acuerdo con las regulaciones polacas sobre el contenido permitido de sustancias que causan riesgos para la salud humana y el medio ambiente, los resultados obtenidos no exceden los estándares para suelos en áreas urbanas (Cu = 200 mg kg-1, Zn = 500 mg kg-1 , Cd = 2 mg kg-1, Pb = 200 mg kg-1)33. Duan et al.34 observaron que el Zn se acumulaba más en raíces que en hojas de A. rosea, lo cual fue confirmado en nuestro estudio; la acumulación más efectiva de Zn también se detectó en A. rosea así como en P. lanceolata y L. multiflorum var. Ponto. Confirmamos información anterior sobre la movilidad del Zn en los tejidos vegetales. La mejor eficiencia de transporte de Zn-TF se detectó en R. acetosa.

Longnecker et al.35 informaron que en plantas tolerantes a niveles tóxicos de Zn, se observó acumulación en la corteza de la raíz y en sus hojas. Detectamos que el cadmio se acumuló efectivamente en las raíces, pero también se transportó eficientemente a las hojas de muestras de A. rosea, P. lanceolata, T. pratense y R. acetosa, como lo demuestran los altos valores del factor de translocación (TF). Si tomamos en cuenta el Zn y el Cd juntos, debemos recordar la interacción entre Zn y Cd, que consiste en la inhibición mutua de la acumulación y en ocasiones de la translocación de elementos en la planta36. Investigaciones recientes demostraron que el uso de un exceso de Zn, junto con con exposición al Cd en condiciones hidropónicas, mitigó la toxicidad del Cd en las plantas al aumentar todos los fenoles y clorofilas en las hojas, mitigando así los efectos adversos del Cd sobre la función fotosintética y la actividad de secreción de oxígeno37. Los autores sugirieron que estos mecanismos están involucrados en la desintoxicación de Zn y la protección contra el daño estructural y funcional de las membranas fotosintéticas inducido por el Cd.

La acumulación de Pb no fue tan efectiva como se mencionó anteriormente para Zn y Cd, pero vale la pena señalar que se encontró una concentración relativamente alta en las hojas de todas las especies examinadas, la más alta en L. multiflorum y R. acetosa. Barrutia et al.38 establecieron que R. acetosa tenía potencial para la bioconcentración de Pb (y también Zn y Cd), a partir de suelos mineros altamente contaminados. Sin embargo, nuestra investigación no confirmó la capacidad de hiperacumulación de este elemento, lo que podría deberse a que existe una cantidad relativamente pequeña en el suelo de los sitios estudiados. El plomo fue transportado eficientemente a la parte superior de la planta en muestras seleccionadas de todas las especies examinadas, especialmente en A. retroflexus y también en A. rosea y P. lanceolata. Yingping et al.39 también confirmaron la movilidad de este ion en Amaranthus spinosus. En Limbarda crithmoides y Helianthus annuus el Pb no fue transportado eficientemente desde las raíces a las hojas40 y solo se acumuló en las raíces.

Teniendo en cuenta el Cu, observamos que L. multiflorum, T. pratense, R. acetosa, A. retroflexus y P. lanceolata mostraron la capacidad de acumular cobre y su rápido transporte desde las raíces a las partes aéreas de la planta. Malizia et al.1 confirmaron que T. pratense tiene potencial para la bioconcentración de cobre.

Nuestros resultados también demuestran una interacción sinérgica entre Cu, Cd y Zn durante la translocación de estos elementos en brotes de Trifolium pratense y Amaranthus retroflexus (Fig. 2). Otros investigadores también han observado que Amaranthus retroflexus acumula metales como Cd, Ni, Pb y Cu en las partes aéreas41. En Rumex acetosa se encontró una interacción entre la translocación de Cd y Zn (Fig. 2), mientras que otros autores42 informaron que el Zn indujo una disminución en la absorción de Cd y un aumento simultáneo en la acumulación de Zn en plantas de tomate. Esto sugirió una fuerte competencia entre Zn y Cd por los mismos transportadores de membrana.

En presencia de iones de metales pesados, las plantas de nuestro estudio no mostraron síntomas característicos de su efecto tóxico sobre la actividad fisiológica. La masa seca, la RWC, la tasa fotosintética neta PN, la conductancia estomática gs y la concentración intercelular de CO2 Ci en las plantas después de la exposición fueron mayores que en las especies de control; sólo en una especie: R. acetosa: detectamos una disminución en estos parámetros en comparación con el control (Tabla 2). Esto puede deberse a cantidades relativamente pequeñas de metales pesados en el medio ambiente y a una exposición relativamente corta. Las plantas hiperacumuladoras de metales tienen la capacidad de acumular un nivel relativamente alto de HM en sus tejidos vegetales y han desarrollado una serie de mecanismos de desintoxicación para la aclimatación y la tolerancia a los metales. El mecanismo de tolerancia al Cd ha sido ampliamente estudiado en muchas especies43. Nuestra investigación demostró que las especies que acumulaban Cd activaban eficazmente mecanismos de desintoxicación para proteger la función del aparato fotosintético contra el estrés del Cd44. Otros autores observaron una disminución en todos los parámetros de la fotosíntesis en Amaranthus spinosus39 y un retraso en la fluorescencia de la clorofila en Lemna minor45.

La contaminación de los tejidos vegetales por metales pesados conduce a la formación de ROS como el peróxido de hidrógeno (H2O2)12. Observamos un aumento en el nivel de ROS en comparación con las plantas de control en todas las plantas después de la exposición. Observamos niveles más altos de H2O2 en todos los órganos de las plantas de T. pratense, R. acetosa, A. rosea y P. lanceolata. El aumento de la producción de ROS en las plantas se asoció con un aumento de la actividad de las enzimas antioxidantes.

Todas las especies examinadas se caracterizaron por el potencial de acumulación de metales pesados. Sin embargo, un proceso de bioacumulación eficaz dependerá de enzimas desintoxicantes activas y de la regulación de las enzimas de defensa primaria. Siempre observamos la inducción de la actividad de las enzimas antioxidantes en raíces y hojas de las plantas, aunque no hubo diferencias significativas entre las plantas investigadas. Los metales pesados modifican las propiedades de las membranas al interactuar con grupos funcionales de proteínas y lípidos de la membrana. Como marcador de peroxidación lipídica46 se utiliza la medición del contenido de malondialdehído (MDA). En nuestra investigación, el nivel de actividad de MDA después de 2 semanas fue mayor que después de 6 semanas de exposición. El aumento de MDA fue inducido tanto por metales esenciales como el Zn como por metales no esenciales como el Pb. Se detectó que un mayor nivel de MDA en raíces y hojas de Lolium multiflorum, Trifolium pratense y Amaranthus retroflexus se correlacionó con altas cantidades de Pb en raíces (Fig.). Lukatkin et al.22 informaron que los niveles de MDA en raíces y hojas de Amaranthus retroflexus se correlacionaban con niveles elevados de Zn. Las isoformas de ascorbato peroxidasa (APOX) juegan papeles importantes y directos como elementos protectores contra condiciones ambientales adversas42. La disminución en la peroxidación lipídica de la membrana observada después de 6 semanas puede deberse a la activación del sistema antioxidante que inactiva ROS. En nuestro estudio, las actividades de APOX fueron generalmente mayores en las hojas que en las raíces en todas las especies. La actividad de APOX fue definitivamente menor que la de la catalasa, especialmente en las partes aéreas, lo que significa que esta enzima complementa la actividad catalítica de CAT. APOX puede ser responsable de controlar los niveles de H2O2 como moléculas señal, y la función CAT es eliminar grandes cantidades de oxígeno durante el estrés oxidativo12. Los perfiles de cambios y el nivel de actividad de CAT fueron diferentes entre hojas y raíces, pero vale la pena señalar que en todos los sitios con exposición de A. retroflexus se observaron mayores valores de actividad de CAT. Mohamed et al.47 demostraron en Brassica juncea que la mayor actividad de las enzimas antioxidantes ofrece una mayor eficiencia de desintoxicación, lo que proporciona una mejor resistencia de las plantas contra el estrés oxidativo inducido por trazas de metales.

Los resultados muestran el alto potencial de acumulación de estas especies y su adecuada respuesta fisiológica al estrés. Para detectar la contaminación ambiental, se deben obtener datos de todas las especies analizadas, y dicho procedimiento determinará de manera más efectiva los niveles de riesgo de contaminación ambiental por metales pesados.

Con base en los resultados obtenidos, se puede concluir que todas las especies mostraron un potencial variado pero generalmente grande para una alta acumulación de oligoelementos detectados. Las concentraciones de todos los elementos en los tejidos vegetales dependieron de la especie, el órgano (raíz versus brote) y las interacciones especie-órgano. La respuesta fisiológica de las especies estudiadas al estrés se correlacionó con el alto contenido de los metales probados en los tejidos. Las plantas expuestas en diferentes sitios de estudio mostraron diferentes concentraciones de oligoelementos en sus tejidos. Debido al diferente grado de capacidad de las especies probadas para acumular oligoelementos, para estimar el grado de contaminación ambiental por estos compuestos, recomendamos el uso simultáneo de todas las especies de malezas que se probaron en este trabajo.

En el futuro, encontrar un bioindicador entre las malas hierbas que tuviera todo un conjunto de excelentes características bioindicadoras proporcionaría un sistema de alerta temprana simple y económico contra los efectos negativos de los cambios en el ecosistema.

Se organizó un experimento para evaluar la capacidad de bioacumulación de Cd, Pb, Cu y Zn en 6 especies de plantas seleccionadas. También se determinó el contenido de estos elementos, su bioconcentración y translocación en plantas y suelo, así como se evaluó el estado de las plantas. Además, los resultados se analizaron mediante análisis estadístico.

Las especies para el estudio se seleccionaron debido a su amplia y común distribución, generalmente en toda Europa. Para esta investigación seleccionamos especies que frecuentemente se encuentran como malezas y especies ornamentales en áreas urbanizadas:

Lolium multiflorum L. (no. 1) es originaria de toda Europa (excepto Finlandia), Asia occidental, meridional y central (excepto Uzbekistán), así como del norte de África. Fue introducido en América, África meridional y oriental, Australia y Asia oriental (Hultén y Fries, 1986; POWO, 2019). Para nuestros propósitos utilizamos la variedad Ponto de Lolium multiflorum, obtenida de Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG (Alemania). Mostró potencial de fitorremediación de metales pesados48.

Trifolium pratense L. (nº 2) comúnmente conocido como trébol rojo. Es una especie originaria de: Europa, Asia meridional, occidental y media, así como del noroeste de África. Introducidas y extendidas en todos los continentes excepto en la Antártida49, 50. Las semillas fueron recolectadas por los autores de las zonas rurales de Gran Polonia;

Rumex acetosa L. (nº 3), también conocida como acedera común, es una planta herbácea originaria de Europa, Asia y el norte de África (Marruecos), y actualmente se ha extendido a todos los continentes excepto Australia y la Antártida49, 50. Las semillas fueron recopilados por los autores de las zonas rurales de Gran Polonia;

Alcea rosea L. (nº 4), la malvarrosa común; Fue importada a Europa desde el suroeste de Asia como especie de planta ornamental antes del siglo XV. Desde entonces, es una planta ornamental común en las ciudades y está muy extendida en América, el norte de África y el sur de Asia como especie silvestre49, 50. En el presente experimento utilizamos Alcea rosea L. Las semillas fueron recolectadas por los autores de las zonas rurales de Gran Polonia. ;

Amaranthus retroflexus L. (no. 5), el amaranto de raíz roja, se encuentra ahora en casi todo el mundo. Es una especie originaria de México. Se introdujo en todos los continentes excepto en la Antártida49, 50. Las semillas se recolectaron en la aglomeración de Poznań;

Plantago lanceolata L. (n° 6), llantén menor; Esta especie notablemente extendida es nativa de toda Europa, África del Norte y Asia occidental, meridional y central, pero se ha introducido ampliamente en otros lugares y ahora se encuentra, por ejemplo, en América, Australia, Nueva Zelanda, Japón y en África meridional y oriental, donde prospera. a gran altitud49, 50. Las semillas fueron recolectadas por los autores de las zonas rurales de Gran Polonia.

Confirmamos que todos los métodos, incluida la recolección de material vegetal, se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

El experimento se llevó a cabo durante la temporada de crecimiento de 2021. El experimento comenzó en abril con la plantación de las semillas en condiciones de invernadero de control (temperatura de 16 a 18 °C, sin luz artificial). Se utilizaron macetas de 5 L con una mezcla estándar de turba y arena (pH 6.8, N: 230 mg L-1, P: 180 mg L-1, K: 350 mg L-1, Mg: 150 mg L-1). El contenido de los elementos probados en la tierra para macetas al inicio del experimento fue de 4,151 ± 0,032 mg kg-1 para Cu, 15,03 ± 0,34 mg kg-1 para Zn, 0,091 ± 0,004 mg kg-1 para Cd y 4,302 ± 0,052 mg. kg-1 para Pb. Las semillas de cada especie se sembraron en macetas individuales en cantidades iguales. Después de la germinación, se dejaron en la maceta diez de las plántulas más grandes y vitales. Durante la germinación y el cultivo en invernadero se utilizó agua desionizada para el riego de las plantas. Después de 60 días, las plantas fueron llevadas a sitios de exposición con diversas condiciones ambientales. Para estas investigaciones se seleccionaron tres lugares de exposición, ubicados en la ciudad de Poznań. El primer sitio (sitio A) estaba ubicado en una zona residencial ubicada en la margen derecha del río Warta (N: 52°23′53′′; E: 16°57′36′′), en la parte oriental del Ciudad de Poznan (Fig. 5). En los alrededores de este sitio de investigación predominaron áreas urbanizadas de alta densidad (viviendas multifamiliares). El segundo sitio de exposición (sitio B) estaba ubicado en el Jardín Botánico de la Universidad Adam Mickiewicz en Poznań, en la margen izquierda del río Warta (N: 52°25′14′′; E: 16°52′39′′) , en la zona occidental de la ciudad. Los alrededores inmediatos eran zonas verdes, mientras que en los alrededores del lugar de exposición C había una zona urbanizada de baja densidad (viviendas unifamiliares) y una carretera principal (N: 52°25′50′′; E: 16° 54′58′′). En cada sitio se colocaron tres macetas con plantas de una determinada especie (en total fueron 18 macetas por sitio). La exposición de las muestras duró 6 semanas (del 1 de junio al 16 de julio de 2021). Durante la exposición, las plantas se regaron con agua destilada y se protegieron del sol directo (sombreadas) por vegetación superior natural, sin efectos negativos para el flujo de aire. La contaminación del aire en los sitios de investigación durante la exposición fue proporcionada por la Dirección General de Protección Ambiental (Tabla S3).

Localización de sitios de exposición en la ciudad de Poznań con información sobre la distancia entre ellos (fuente: estudio propio basado en datos de National Geodetic and Cartographic Resource y

En el laboratorio, las muestras de plantas se purificaron primero con agua desionizada utilizando sistemas de purificación de agua Milli-Q Advantage A10, Merck Millipore (Merck, Darmstadt, Alemania), y se separaron en hojas y raíces. Las muestras de suelo de todas las macetas fueron tamizadas (2 mm). Para lograr un peso seco constante, las muestras de plantas y suelo se secaron a 40 ± 3 °C en un horno eléctrico (FD115, Binder, Alemania). La digestión de las muestras en polvo de planta (muestras homogéneas de cada maceta) y suelo se llevó a cabo en el sistema de mineralización por microondas CEM Mars 5 Xpress (CEM, EE. UU.). De cada planta se colocaron 0.3000 ± 0.0001 g de hojas o raíces en un recipiente de teflón con 8 mL de HNO3 concentrado (65%) (pureza analítica, Merck, Darmstadt, Alemania) y 1 mL de H2O2 (Merck, Darmstadt, Alemania). . El programa de digestión incluía las siguientes etapas: primera etapa: temperatura hasta 80°C, 10 min, potencia 600 W; segunda etapa: temperatura 140 °C, 12 min, potencia 1200 W; tercera etapa: temperatura 185 °C, 15 min, potencia 1200 W. Después de los pasos de digestión utilizando papeles de filtro cualitativos (grado 595: Whatman de 4 a 7 μm, GB), las soluciones se filtraron, se colocaron en matraces y se completaron hasta una disolución final. Volumen de 15 mL con agua desionizada. El análisis de la concentración del elemento en el suelo se realizó de acuerdo con la norma PN-EN 16174. Los blancos de procedimiento y los materiales de referencia se llevaron a cabo de la misma manera que las muestras en cada ejecución de digestión.

El análisis elemental de Cu, Zn, Cd y Pb se llevó a cabo utilizando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS 7100 × Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un sistema de reacción octopolo (ORS), nebulizador concéntrico MicroMist, cuarzo. Cámara de pulverización de doble paso Scott, conos de Ni y espectrómetro de masas cuadrupolo. Los parámetros instrumentales se optimizaron utilizando la Tuning Solution (Agilent). Las condiciones típicas de funcionamiento del instrumento para los espectrómetros ICP-MS fueron las siguientes: 1550 W para potencia de RF, 15 L min-1 para caudal de gas de plasma, 0,98 L min-1 para caudal de gas nebulizador, 0,9 L min-1 para gas auxiliar tasa de flujo. Para la reducción de interferencias espectrales se utilizó el modo helio. Las interferencias no espectrales y de matriz se redujeron diluyendo las muestras y utilizando una solución de estándar interno que contenía 10 µg L-1 de Rh introducida en paralelo con todas las soluciones analizadas. Se utilizó argón de alta pureza (99,999%) como gas nebulizador, auxiliar y plasma para el ICP-MS (Messer, Chorzów, Polonia). Las soluciones de calibración se prepararon mediante una dilución adecuada de 10 mg L-1 de solución madre multielemental en HNO3 al 5 % (Estándar de calibración multielemento 3, PerkinElmer, MA, EE. UU.). Las curvas de calibración se construyeron en los rangos de concentración: 0,05–50 µg L−1 para Cd y Pb y 0,1–200,0 µg L−1 para Cu y Zn.

Para evaluar la veracidad y establecer la trazabilidad del resultado de la medición, se utilizaron materiales de referencia certificados (CRM): NIST SRM 1570a Trace Elements in Spinach Leaves (EE. UU.), NIST SRM 2711a Montana Soil. Se evaluaron los parámetros de validación linealidad, precisión, límites de detección (LOD) y veracidad. La linealidad de la curva de calibración se calculó como el coeficiente de correlación (R), cuyo valor es superior a 0,9996 para todos los analitos. El LOD para elementos determinados se calculó según LOD = 3,3 S/b, donde S significa desviación estándar de los resultados obtenidos para las muestras en blanco y b es la sensibilidad (n = 5). Los valores de LOD fueron los siguientes: Cd 0,007 µg g-1, Cu 0,036 µg g-1, Pb 0,008 µg g-1 y Zn 0,092 µg g-1. Los valores de precisión se calcularon como el coeficiente de variación (CV) (%) que oscila entre 0,8 y 2,3% para todos los elementos. La veracidad se evaluó aplicando los materiales de referencia certificados y se expresó como recuperación (%). Los valores de recuperación oscilaron entre 97 y 102% para las plantas y entre 93 y 98% para el suelo, respectivamente. Los resultados de la prueba t de Student también confirmaron que no había diferencias significativas entre la concentración medida ± DE y la concentración certificada ± incertidumbre estándar.

Para estimar la eficiencia de la fitoextracción de metales pesados por parte de las especies vegetales estudiadas en tres sitios de investigación, se calcularon dos factores: bioconcentración y translocación. La relación entre la acumulación de metales pesados en muestras de raíces y la acumulación de metales pesados en muestras de suelo se utilizó para calcular el factor de bioconcentración (FBC) de metales pesados51:

El factor de translocación (TF) es la eficiencia de la transferencia de metales pesados a la biomasa aérea52, utilizándose hojas y raíces en el análisis:

Para determinar el contenido de clorofila, el experimento se realizó en un laboratorio, donde se trajeron plantas de los tres lugares del experimento. Para evitar la degradación de la clorofila, el experimento se llevó a cabo en condiciones de luz tenue durante los análisis y el período de almacenamiento. Se realizaron tres réplicas para cada muestra de planta. Para determinar el contenido de clorofila en las plantas, primero se cortaron hojas intactas de la planta que pesaron aproximadamente 0,100 g. Las muestras pesadas se cortaron en trozos más pequeños y se colocaron en un tubo de ensayo, luego se agregaron 5 mL de DMSO al 99,5%, los tubos de ensayo se cerraron con un tapón y se colocaron en el refrigerador por 24 h. Después de 24 h, las muestras se colocaron en un baño de agua a aproximadamente 65 °C durante 30 a 45 minutos para extraer la clorofila de la lámina de la hoja. Luego, el extracto de clorofila se transfirió a una cubeta de 1 cm y se midió la absorbancia en el espectrómetro Hach Lange DR-2800, a tres longitudes de onda: 645 nm, 652 nm y 663 nm. Paralelamente se realizó la determinación de materia seca de cada muestra de planta. El contenido de clorofila en las muestras se calculó mediante la fórmula de Arnon53.

Para determinar la estabilidad de la membrana celular de cada planta, se cortaron 2 cm2 de hojas verdes (sin dañarlas). Las hojas cortadas se enjuagaron tres veces con agua bidestilada y se colocaron en vasos de vidrio de 25 mL, se sumergieron en 10 mL de agua destilada, luego se cubrieron con papel de aluminio y se colocaron en refrigerador por 24 h. Se repitió el mismo proceso después de 24 h: se eliminó el agua destilada, se enjuagaron las hojas y se colocaron en los mismos vasos de vidrio, se sumergieron en 10 mL de agua bidestilada, se taparon con papel de aluminio y se metieron en el refrigerador por las siguientes 24 h. h. Después de 24 h, las muestras se sacaron del frigorífico y a temperatura ambiente se midió su conductancia inicial. Después de cada medida las muestras se cubrieron con papel de aluminio. Luego las muestras se esterilizaron en autoclave a 0,5 atm, 105 °C durante 30 min. Después de esos procesos, las muestras se enfriaron a 25 °C y se midió la conductancia final. Sus respectivas conductividades eléctricas C1 y C2 se midieron mediante conductímetros. El índice de estabilidad de la membrana se calculó utilizando la ecuación según la fórmula de Almeselmani et al.54.

La estimación del contenido relativo de agua de la hoja (RWC) se realizó cortando de 3 a 4 trozos de lámina de la hoja (sin lesiones). Las piezas se pesaron y se colocaron en vasos de vidrio. Las hojas se hicieron puré en 100 mL de agua destilada (completamente sumergidas) y se cubrieron con papel de aluminio y se colocaron en el refrigerador por 12 h. Después de 12 h, se eliminó el agua de los vasos de vidrio y las muestras se secaron con papel de seda y luego se pesaron nuevamente. Luego de pesar las muestras, se colocaron nuevamente en los mismos vasos y se secaron a 60 °C durante 70 h. Después de 70 h, las muestras se enfriaron en un desecador y se pesaron nuevamente. El valor RWC se calculó según la fórmula de55.

Para determinar el contenido de materia seca en las hojas se utilizó el método del peso seco. Para cada planta se realizaron tres repeticiones. Se cortó aproximadamente 1 g de hojas de la planta y se colocaron en un vaso de precipitado, el cual se cerró con un vidrio de reloj y se colocó en una secadora durante 24 h. Las plantas se secaron a 105 °C hasta que tuvieron un peso constante. El contenido de materia seca se calculó con base en el peso de las plantas antes y después del secado, utilizando la fórmula de Ostrowska et al.56.

Al principio, a la mitad y al final de cada serie de exposición, medimos tres parámetros de intensidad: fotosíntesis neta (PN), concentración de CO2 intercelular (Ci) y conductancia estomática (gs). Para la medición, se seleccionaron hojas maduras sin daño mecánico. El análisis del intercambio de gases se realizó entre las 09:00 y las 15:00 con la ayuda del sistema de fotosíntesis portátil Ci 340aa (CID Bioscience Inc., Camas, WA, EE. UU.). Para garantizar condiciones similares de medición en la cámara foliar, se proporcionaron condiciones estables: concentración de entrada de CO2 (410 µmol (CO2) mol-1), densidad de flujo de fotones fotosintéticos (PPFD) 1000 µmol (fotón) m-2 s-1, a temperatura de la cámara de 25 °C y humedad relativa de 50 ± 3%.

El contenido de peróxido de hidrógeno se determinó mediante el método descrito por Patterson et al.57. La disminución de la absorbancia se midió a 508 nm utilizando un espectrofotómetro UV-VIS (Shimadzu Scientific Instruments, Japón). La mezcla de reacción contenía tampón fosfato 50 mM (pH 8,4) y reactivos, 4-(-2-piridilazo)resorcinol 0,6 mM y oxalato de potasio-titanio 0,6 mM (1:1). La concentración correspondiente de H2O2 se determinó frente a la curva estándar de H2O2.

La actividad de la catalasa (CAT, EC 1.11.1.6) se determinó midiendo directamente la descomposición de H2O2 a 240 nm durante 3 minutos como lo describe Aebi58 en un tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) que contiene H2O2 5 mM y extracto enzimático. La actividad CAT se determinó utilizando el coeficiente de extinción de 36 mM-1 cm-1 para H2O2. La actividad de la ascorbato peroxidasa (APOX, EC 1.11.1.11) se analizó utilizando el método descrito por Nakano y Asada59 monitoreando la velocidad de oxidación del ascorbato a 290 nm (coeficiente de extinción de 2,9 mM-1 cm-1) durante 3 min. La mezcla de reacción constaba de 25 a 50 μl de sobrenadante, tampón fosfato 50 mM (pH 7,0), H2O2 20 μM, ascorbato 0,2 mM y EDTA 0,2 mM.

El contenido de malondialdehído (MDA) se determinó mediante reacción con ácido tiobarbitúrico (TBA) como describen Heath y Packer60. Los contenidos de proteínas solubles totales se determinaron según el método de Bradford61 utilizando el kit de ensayo Bio-Rad con albúmina sérica bovina como estándar de calibración.

Para la determinación in vivo de peróxido de hidrógeno utilizamos una versión modificada del método descrito por Afzal et al.62. Todas las muestras de plantas se sumergieron durante 12 h en diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) 4 µM en dimetilsulfóxido (DMSO) 5 mM. Después de enjuagar con tampón fosfato 50 mM (pH 7,4), las raíces se observaron con un microscopio confocal (Zeiss LSM 510, Axiovert 200 M, Jena, Alemania) equipado con no. 10 juegos de filtros (excitación 450–490 nm, emisión 520 nm o más).

Se realizó un análisis estadístico descriptivo para evaluar las concentraciones de metales pesados en las especies de plantas examinadas de diferentes muestras y también la concentración del sistema de defensa y los parámetros fisiológicos. El análisis estadístico se realizó para 72 macetas (por separado para hojas, raíces y suelo). Todas las muestras siguieron supuestos de normalidad y homogeneidad de distribución. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA de dos vías) para evaluar la significancia de las diferencias entre especies y ubicación para todos los parámetros y, finalmente, se aplicó la prueba de Scheffé para mostrar la existencia de grupos uniformes de objetos (suelos, raíces y hojas, por separado). ) (α ≤ 0,05). Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para evaluar asociaciones entre contenidos elementales y diferentes ciudades y determinar interacciones entre variables independientes (relaciones entre contenidos elementales en especies, ubicación y parámetros fisiológicos), sin suposiciones a priori. Se realizaron análisis de conglomerados con procedimientos de agrupación de objetos y características utilizando la plataforma R (R Core 2014), para encontrar similitudes entre sitios, especies y acumulaciones de metales pesados. Los datos se visualizaron utilizando mapas de calor para comparar la concentración de un grupo particular de elementos en plantas y suelos en sitios de investigación específicos, con variables bidimensionales (sitios de investigación, elementos) representadas por colores.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico (Statistica 13.1) y plataforma informática R (R Core, 2014).

Todos los datos incluidos en este estudio están disponibles previa solicitud contactando al autor correspondiente.

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Agradecemos a Barbara Andrzejewska por el apoyo técnico en el laboratorio. Nuestro más sincero agradecimiento a Erjon Qorri por su ayuda en la preparación gráfica de los resultados estadísticos. También agradecemos al Prof. Zbigniew Celka del Departamento de Biología de la Universidad Adam Mickiewicz de Poznań por su ayuda en la recolección de semillas. Estamos en deuda con la Prof. Justyna Wiland-Szymańska, quien nos permitió utilizar parcelas experimentales en el Jardín Botánico de la Universidad Adam Mickiewicz de Poznań. Nuestro más sincero agradecimiento a Norddeutsche Pflanzenzucht Hans-Georg Lembke KG (Alemania) por enviar el material de semilla de la variedad Ponto de Lolium multiflorum.

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Facultad de Ingeniería Mecánica y Ambiental de la Universidad de Ciencias de la Vida de Poznań.

Departamento de Ecología y Protección Ambiental, Facultad de Ingeniería Mecánica y Ambiental, Universidad de Ciencias de la Vida de Poznań, Piątkowska 94C, 60-649, Poznań, Polonia

A. Cakaj, M. Lisiak-Zielińska, K. Borowiak y M. Drapikowska

Departamento de Análisis de Trazas, Facultad de Química, Universidad Adam Mickiewicz, Uniwersytet Poznańskiego 8, 61-614, Poznań, Polonia

A. Hanc

Unidad de Epidemiología y Prevención del Cáncer, Centro Oncológico de la Gran Polonia, Calle Garbary 15, 61-866, Poznan, Polonia

A. Małecka

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AC-Conceptualización, investigación de campo, análisis bioquímico, preparación parcial de borradores. MLZ-Conceptualización, análisis bioquímico, preparación parcial del borrador, edición. AH-Análisis químico, en parte preparación de borradores. AM-Análisis bioquímico, análisis de microscopía confocal. KB-Análisis bioquímico, en parte preparación de borradores. MD-Conceptualización, evaluación estadística, preparación y edición parcial del borrador.

Correspondencia al señor Drapikowska.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Cakaj, A., Lisiak-Zielińska, M., Hanć, A. et al. Malezas comunes como bioindicadores de metales pesados: un nuevo enfoque en biomonitoreo. Informe científico 13, 6926 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34019-9

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Recibido: 27 de febrero de 2023

Aceptado: 22 de abril de 2023

Publicado: 28 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34019-9

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