El microbioma oscuro y la materia orgánica extremadamente baja en el delta fósil de Atacama revelan los límites de detección de vida en Marte

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 808 (2023) Citar este artículo

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Identificar señales inequívocas de vida en Marte es uno de los objetivos más importantes para el envío de misiones al planeta rojo. Aquí informamos sobre Red Stone, un delta de abanico aluvial de 163-100 millones de años que se formó en condiciones áridas en el desierto de Atacama, rico en hematita y lutitas que contienen arcillas como vermiculita y esmectitas y, por lo tanto, geológicamente análogo a Marte. Mostramos que las muestras de Red Stone muestran una cantidad importante de microorganismos con una tasa inusualmente alta de indeterminación filogenética, lo que llamamos "microbioma oscuro", y una mezcla de biofirmas de microorganismos antiguos y existentes que apenas pueden detectarse con el estado de -Equipos de laboratorio de última generación. Nuestros análisis realizados por instrumentos de banco de pruebas que están en Marte o que se enviarán a Marte revelan que, aunque la mineralogía de la Piedra Roja coincide con la detectada por instrumentos terrestres en el planeta rojo, niveles igualmente bajos de compuestos orgánicos serán difíciles, si no imposibles, de detectar en Marte. Rocas marcianas según el instrumento y técnica utilizada. Nuestros resultados enfatizan la importancia de devolver muestras a la Tierra para determinar de manera concluyente si alguna vez existió vida en Marte.

Las misiones pasadas, actuales y futuras a Marte están motivadas principalmente por la cuestión pendiente de si alguna vez existió vida en el planeta rojo1. Misiones aterrizadas como los rovers de exploración de Marte, Phoenix y los rovers activos Mars Science Laboratory (MSL) y Mars2020 tuvieron la tarea de identificar ambientes habitables y si existen evidencias de los requisitos para la vida tal como la conocemos2,3. El agua líquida es uno de los principales requisitos, por lo que muchos rovers han aterrizado en sitios con evidencia geomorfológica de ríos y lagos antiguos y/o evidencia mineralógica de agua líquida, como minerales arcillosos4,5,6. Estas naves espaciales están equipadas con varios instrumentos de composición para identificar minerales y buscar moléculas en bruto necesarias para la vida. Los espectrómetros de masas de Viking, Phoenix, MSL, Mars2020 y el futuro rover ExoMars, por ejemplo, pueden detectar moléculas orgánicas y los componentes básicos de la vida7,8,9,10. Aunque las mediciones de Viking o Phoenix11,12 no encontraron pruebas sólidas de materia orgánica en suelos marcianos, tanto el conjunto de instrumentos de Análisis de Muestras en Marte (SAM) en MSL como el instrumento de Escaneo de Ambientes Habitables con Raman y Luminiscencia para Orgánicos y Químicos (SHERLOC) en Mars2020 ha identificado moléculas orgánicas alifáticas y aromáticas simples (es decir, ~450 ppm en lutita de Yellowknife Bay en el cráter Gale13,14).

Los resultados obtenidos hasta el momento en Marte sugieren que los compuestos orgánicos no prevalecen en su superficie, pero aquí planteamos la hipótesis de que las limitaciones actuales de los instrumentos15 y la naturaleza de los compuestos orgánicos en las rocas marcianas también pueden obstaculizar nuestra capacidad de encontrar evidencias de vida en el planeta rojo. En este trabajo ponemos a prueba estas limitaciones inspeccionando de cerca Red Stone, un sitio único ubicado en el desierto de Atacama, el desierto más seco16,17,18 y más antiguo de la Tierra19,20,21,22,23,24, y un conocido planeta de Marte. modelo analógico22.

Piedra Roja se ubica al sur de la ciudad de Antofagasta en la Quebrada del Boku (Fig. 1A, B y Fig. 2), parte del Grupo Vía superior, una secuencia sedimentaria de un delta de abanico aluvial compuesto por las formaciones Coloso y Lombriz que datan del Cretácico Temprano al Jurásico Tardío (Fig. 1C y Fig. 2B)25. El Grupo Way representa dos fases distintas de la evolución de la cuenca, registrando la sucesión completa del delta proximal a distal hasta la posterior incursión marina progresiva y la deposición del delta26. La base de la formación Lombriz muestra areniscas y lutitas rojas intercaladas con abundantes vetas perpendiculares y costras de halita endurecidas (Fig. 1D, E y Fig. 3). Avanzando por secciones, hay unidades de conglomerados cementados, areniscas y lutitas intercaladas, rematadas por conglomerados sueltos erosionados (Fig. 1E y Fig. 3).

Un lugar de Piedra Roja en el desierto de Atacama (modelo digital de terreno86). B Imagen de satélite ampliada en la región circundante (datos de satélite Sentinel 2020). C Reconstrucción paleogeográfica del sistema aluvial/delta mostrado en B, según el registro sedimentario reportado de la formación Caleta Coloso-El Way (modificado de Flint, S. Clemmey, H. & Turner, P. The Lower Cretaceous Way Group of Northern Chile: un complejo de abanico aluvial-delta (Sediment. Geology 46, 1-22 (1986) 25,87). Las flechas negras en C muestran la dirección del flujo del antiguo delta del río, cuyo punto de origen se encuentra ahora bajo el Océano Pacífico. El punto rojo en A, B y C muestra la ubicación del afloramiento que se muestra en E. D La columna estratigráfica del afloramiento estudiado se muestra en el panel E. Las flechas rojas muestran los puntos de recolección de muestras. E Vista cercana del afloramiento estudiado. De arriba a abajo: zona superior UZ, U1 Unidad 1, ubicación del sensor en la pared WI, Unidad 2 U2, ubicación del sensor fuera de la pared WO, zona inferior LZ.

Una vista panorámica del sitio inspeccionado. B Mapa geológico de la formación Caleta Coloso-El Way (SERNAGEOMIN, 2003. Mapa Geológico de Chile: versión digital88). JK1c (verde claro); Secuencias sedimentarias transicionales aluviales, fluviales y eólicas. Cretácico temprano al Jurásico tardío (arenisca, caliza, lutita, conglomerado, limolita). Ki1m (verde); Secuencias sedimentarias marinas costeras. Cretácico Inferior (arenisca, caliza, marga, calcarenita). M1c (marrón claro); secuencias sedimentarias de abanicos aluviales. Mioceno (arena, grava, limo, ignimbrita). J3i (violeta claro); Secuencias volcánicas del Jurásico continental y marino (basaltos, andesitas, tobas, calizas).

A Top conglomerados sueltos erosionados. B Conglomerados cementados. C, D Muestra areniscas (s) con lutitas de capa fina (m). Las flechas blancas apuntan a vetas de halita/yeso. E Una de las vetas de evaporita tras ser rota, dejando al descubierto la halita/yeso en su interior y la fina capa de hematita que las recubre. F Corteza fibrosa de halita paralela a la superficie del afloramiento, sólo observable después de haber sido expuesta.

El conjunto de minerales secundarios de las facies sedimentarias de Red Stone tiene similitudes con el antiguo Marte, lo que sugiere historias diagenéticas comparables. Además de cuarzo y plagioclasa, las areniscas se componen de zeolita (analcima), calcita, yeso, halita, clorita, vermiculita, illita/moscovita y hematita (Fig. S1A). La hematita es un marcador de alteración acuosa oxidativa en Marte27,28,29 y está presente en Red Stone como cristales bien desarrollados y delgadas capas minerales (Fig. S1B, C), lo que le da un color rojo característico a este sitio (Fig. 2A). ). La presencia de halita y yeso, vetas y costras blancas transversales en las facies inferiores de arenisca y lutita de Red Stone, además de la halita que cementa las facies superiores de arenisca (Fig. 1D, E y Fig. 3), respaldan las condiciones áridas durante la deposición de los sedimentos de este delta (se han identificado halita y yeso en antiguas superficies marcianas desde órbita e in situ30,31,32,33). Los filosilicatos abundan en las antiguas superficies marcianas y están dominados por la esmectita y la clorita34. De manera similar, las lutitas de Red Stone contienen esmectita (saponita y montmorillonita) y clorita, junto con illita y vermiculita (Fig. S1A y Fig. S1D). La presencia de cloritas sugiere condiciones diagenéticas de baja temperatura (70-90 °C)35, similares a las temperaturas experimentadas por las rocas sedimentarias en el cráter Gale investigadas por MSL36. Los patrones de difracción de rayos X (XRD) a diferentes humedades relativas (RH) muestran que la posición máxima del clorito se mueve ligeramente debido a la extensión de la distancia entre capas, lo que sugiere que el clorito puede estar absorbiendo pequeñas cantidades de vapor de agua en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. humedad relativa (HR) (Fig. S2), un hallazgo de interés para la inspección de la habitabilidad potencial de este tipo de arcilla en Marte. El cemento analcima, junto con las arcillas autigénicas, la calcita y el cuarzo37, es típico de las salmueras que se evaporan en cuencas cerradas, similares a los lagos que se formaron en cuencas de impacto en Marte hace entre 3 y 4 mil millones de años38. Patrones de meteorización utilizando el análisis A-CN-K [Al2O3-(CaO + Na2O) – K2O]39,40 (Fig. S3A), junto con ACN [Al2O3-(CaO + Na2O)] y A-CNK-FM [Al2O3 – ( CaO + Na2O + K2O) - (FeOT + MgO)] análisis geoquímicos (Fig. S3B, C) también son indicativos de diagénesis, y las variaciones en el ACN en algunas de las muestras también sugieren otros procesos en acción, como el hidrotermalismo.

Los registradores duales de temperatura/humedad relativa in situ mostraron que los conglomerados sueltos superiores más expuestos mostraban los valores más altos de HR (Fig. S4), con hasta un 85,1% durante la noche y las primeras horas de la mañana, lo que coincide con la exposición regular a las nieblas en esta región. como principal fuente de agua para la vida microbiana41.

Las muestras de Red Stone contienen como máximo 1 μg de ADN por gramo de suelo, con análisis de secuenciación de próxima generación (NGS) de 16 S rRNA que muestran que el mayor número de especies se encontraba entre las alfaproteobacterias y las actinobacterias (Fig. 4A y Tabla S1). La mayor diversidad de Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) se encontró en los conglomerados erosionados más superiores (Fig. 4B), lo que coincide con la mayor disponibilidad de agua. Una correlación entre los valores más altos de HR y la diversidad microbiana de NGS confirmó la gran cantidad de OTU en los conglomerados superiores (Fig. S5A), y también reveló una cantidad ligeramente mayor de OTU en la zona donde se encuentran las evaporitas, en línea con el papel de estas. minerales al proporcionar una fuente de agua para la vida microbiana debido a la absorción de vapor de agua en respuesta a cambios en la humedad relativa. Las OTU de la zona superior también se encuentran en la zona donde se registran las temperaturas superficiales más altas durante las horas del día (Fig. S4 y Fig. S5B), lo que sugiere que dichas especies son al menos termotolerantes.

Un mapa de calor de los principales filos bacterianos determinado por NGS. Los números representan porcentajes del total de secuencias. La intensidad del color en cada cuadro indica el porcentaje relativo de cada filo. B Índices de riqueza (S, barras) y diversidad de Shannon (H', puntos) para las comunidades procarióticas analizadas. C Clasificación jerárquica de las secuencias bacterianas encontradas por NGS. Los colores de la escala de grises identifican clasificaciones de mayor jerarquía.

Una fracción sustancial de las secuencias de ARNr de NGS 16 S cayeron en la categoría "sin clasificar" (8,9%) (Fig. 4A), mientras que el 40,8% de las secuencias restantes no pudieron asignarse más allá de taxones superiores, como el orden o el dominio (Fig. 4C), revelando así un alto grado inusual de indeterminación filogenética. El concepto de “materia oscura microbiana” se ha propuesto recientemente para referirse a la porción aún inexplorada de la diversidad microbiana compuesta por microorganismos no caracterizados de filos conocidos y filos candidatos sin representantes cultivados42,43,44. En cambio, aquí proponemos el nuevo concepto de “microbioma oscuro” para referirnos a la comunidad de microorganismos que pueden detectarse con métodos de alto rendimiento como la secuenciación directa de ADN (como es el caso de las muestras de Red Stone), pero cuya identidad filogenética aún no puede determinarse. determinado. Por lo tanto, el microbioma oscuro de la Piedra Roja puede estar compuesto por especies existentes verdaderamente novedosas que no se encuentran en ningún otro lugar de la Tierra, pero también puede darse el caso de que dicho microbioma oscuro represente de hecho la comunidad relicta de especies microbianas que solían habitar el delta de la Piedra Roja. en un pasado lejano, de los cuales no se encuentran parientes existentes en las bases de datos de secuencias existentes.

Un enfoque dependiente del cultivo nos permitió obtener solo diecinueve aislados bacterianos y dos fúngicos únicos de todo el conjunto de muestras de Red Stone (Fig. S6), con números extremadamente bajos de unidades formadoras de colonias (UFC) (1,1 × 101 – 9,0 × 101, Tabla S2), y casi todas las especies bacterianas pertenecientes a la familia Bacillaceae de bacterias heterótrofas, de acuerdo con los hallazgos de NGS. La mayoría de estas especies coincidían de manera única con la mineralogía de las muestras de donde fueron aisladas (es decir, se encontró Halobacillus en muestras de evaporita), lo que refleja sus preferencias ecológicas. Se sabe que todas las bacterias aisladas en este sitio utilizan polvo eólico para moverse a través de Atacama45, lo que sugiere que la región costera en la que se encuentra Red Stone es el principal punto de origen de muchas de las especies que se encuentran tierra adentro.

El análisis elemental reveló contenidos muy bajos de carbono orgánico total (TOC) provenientes de este conjunto único de microorganismos, con un máximo de 0,11% de peso seco, y ningún nitrógeno detectable (Tabla 1). La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) mostró que la fracción lipídica de este TOC estaba compuesta principalmente de hidrocarburos y ácidos grasos (Fig. 5A). El análisis isotópico de carbono estable mostró valores de δ13C de −19,5 a −26,5 ‰ (Fig. 5B), siendo las muestras de evaporita las más enriquecidas y las que tienen el TOC más alto. Los lípidos característicos de las membranas eucariotas, como los esteroles, no pudieron detectarse mediante GC-MS. La presencia de ácidos grasos con un grupo metilo en la penúltima posición de la cadena ácida (es decir, iso-17:0) sugiere entradas bacterianas donde las bacterias reductoras de sulfato pueden representar una fracción sustancial46. El enriquecimiento de 13C observado en las evaporitas en relación con otras muestras, junto con la detección de ácidos grasos monoinsaturados, isoprenoides (pristano y fitano), heptadeceno y varios monometilalcanos de cadena media, sugieren un origen en fotótrofos como las cianobacterias47,48,49 . Sin embargo, dado que ni la NGS, los análisis microscópicos (campo brillante y autofluorescencia de clorofila) ni los cultivos detectaron tales especies, estas biofirmas pueden representar los restos antiguos de los miembros fototróficos del microbioma oscuro que habitaba el abanico aluvial de Red Stone antes de que fuera litificado. . Esta hipótesis también es coherente con el análisis de las muestras de lutitas, que también revelaron la presencia de una serie de hopanos de carbonos C27 a C31 (Fig. 5A). Los hopanos son los fósiles moleculares más recalcitrantes de hopanoides, lípidos similares a los esteroides de la familia de los isoprenoides producidos principalmente por bacterias50, nuevamente una posible firma biológica de los antiguos habitantes del delta de la Piedra Roja.

A Contenido de lípidos, incluidos alcanos normales (es decir, de cadena lineal), ácidos grasos normales y ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), identificados mediante espectrometría de masas con cromatografía de gases (GC-MS). Los rangos de números de carbono se indican entre paréntesis. B Se encontraron valores de carbono orgánico total (TOC, % dw) y composición isotópica de carbono estable (δ13C, ‰). C, D y E muestran las muestras analizadas mediante espectroscopía Raman, mientras que (F) muestra un control positivo en el que se depositó un lípido sobre un sustrato amorfo rico en sílice (panel F modificado con autorización de Carrizo et al.89).

La proporción de la suma de n-ácidos grasos sobre la suma de n-alcanos puede proporcionar una medida de la frescura de la biomasa en un ambiente determinado. Como los grupos funcionales de oxígeno como el carboxilo tienden a descomponerse con el tiempo, mientras que los hidrocarburos más resistentes se acumulan (es decir, alcanos), las proporciones relativamente altas de n-ácidos grasos/n-alcanos pueden interpretarse como un signo de biomasa más fresca51. Las muestras de la parte superior de la estratigrafía y las evaporitas mostraron las proporciones más altas (≥16; Tabla 1), lo que sugiere que estas muestras contienen la biomasa más fresca/reciente, consistente con la mayor diversidad microbiana determinada por NGS y la mayor disponibilidad de agua en estas muestras.

La espectroscopia Raman utilizando una fuente de 532 nm, similar al Raman en el conjunto de instrumentos SuperCam del rover Mars 2020, confirmó la presencia de los minerales detectados por XRD (Fig. S7), pero no pudo encontrar ninguna firma de lípidos (Fig. 5C-F). , que revela la elección adecuada y crítica de parámetros Raman, como la fuente del láser y el tamaño del punto, en la detección de diferentes tipos de compuestos orgánicos cuando las concentraciones son extremadamente bajas.

La tinción de ADN con SYBR Green fue exitosa para una sola muestra de la zona inferior, que reveló algunas células cocoides y bacilares (Fig. S8). Sin embargo, la hibridación in situ por depósito-fluorescencia catalizada de reporteros (CARD-FISH) pudo detectar niveles extremadamente bajos de bacterias y arqueas (Figs. S9, S10) en todas las muestras, con los recuentos más altos (solo 6 × 105 células por gramo de muestra) observado en las muestras de conglomerados superiores, nuevamente consistente con estas muestras que tienen la mayor biodiversidad y disponibilidad de agua.

Dado que varias de las técnicas utilizadas para caracterizar por primera vez las muestras de Piedra Roja dieron evidencia de vida en el límite de detección, era interesante inspeccionar lo que un conjunto de instrumentos de banco de pruebas en Marte y que se enviarían a Marte detectarían en muestras de Piedra Roja, como Las misiones actuales y futuras están investigando específicamente abanicos/deltas en abanico ricos en arcilla52,53.

Si bien técnicas como DRIFTS (espectroscopia de transformada infrarroja de Fourier de reflectancia difusa), RLS (espectrómetro láser Raman simulador de ExoMars) y LIBS (espectroscopia de descomposición inducida por láser a bordo de los rovers Curiosity y Perseverance) coincidieron estrechamente con la composición mineralógica del sitio (Figs. S11– S13, Tabla S3 y Tabla S4), la detección de sustancias orgánicas resultó ser mucho más desafiante.

La detección de DRIFTS de materia orgánica fue apenas posible en la región NIR (Fig. S11A), ya que las bandas más fuertes de las vibraciones en las redes minerales oscurecieron las bandas potenciales de la materia orgánica. Solo un pico a 1,36 μm en los espectros de la muestra de Red Stone podría explicarse por bandas de compuestos orgánicos no fundamentales. Por el contrario, se observaron muchas bandas (aunque muy débiles) atribuibles a compuestos orgánicos en la región espectral del infrarrojo medio (MIR) (Fig. S11B; asignaciones en la Tabla S5).

La pirólisis tipo SAM54 de muestras de Red Stone detectó una serie de compuestos orgánicos diferentes (Fig. S14), incluidos aromáticos, aromáticos que contienen oxígeno, cloroaromáticos y aromáticos que contienen azufre. Los compuestos orgánicos específicos, como los alcanos de cadena lineal C12-C35 en muestras UZ, U1 y U2, se detectaron en baja abundancia relativa en comparación con otros compuestos orgánicos (Fig. S14) y se identificaron por sus espectros de masas y tiempos de retención utilizando alcanos C10-C40. estándar. El hecho de que se detectaran alcanos en el límite de detección del instrumento comercial utilizado indica que podrían no ser detectables utilizando el modelo de vuelo SAM, que tiene un límite de detección aproximadamente diez veces menor en comparación con la versión comercial utilizada aquí (~ppbv) . Sin embargo, los experimentos de química húmeda de derivatización tipo SAM utilizando MTBSTFA-DMF (ver métodos) identificaron moléculas polares y derivatizaron ácidos n-carboxílicos C7-C20 en todas las muestras, revelando prolina como el único aminoácido detectado (solo en las muestras del conglomerado superior, Fig. . S15), consistente con el metabolismo activo de las bacterias en esta muestra en particular. La detección de ácidos grasos dicarboxílicos e insaturados, junto con el hallazgo de ácidos grasos C16 y C18 y prolina, sugieren que estos compuestos orgánicos serían detectados por el instrumento SAM en Marte. Sin embargo, esto sólo sería posible si estas moléculas son abundantes y sometidas a variables instrumentales que podrían desempeñar un papel adicional en su detección, como las limitaciones de temperatura del instrumento (columna, trampa, líneas de transferencia, etc.), el tiempo límite del análisis de vuelo, la capacidad de desorción de la(s) trampa(s), etc.

Cuando las muestras de Red Stone se analizaron mediante pirólisis instantánea con el instrumento de banco de pruebas MOMA55 (el analizador de moléculas orgánicas de Marte a bordo del rover Rosalind Franklin ExoMars), no se detectaron sustancias orgánicas (Fig. S16). Sin embargo, cuando estas muestras se derivatizaron con MTBSTFA-DMF (derivatización directa y extracción antes de la derivatización), se identificaron algunos picos, pero solo en muestras de evaporita; especies de ácido carboxílico alifático derivatizadas mediante sililación de su grupo lábil –OH (Fig. S17). Estos resultados no solo revelaron que la mayoría de las muestras de Red Stone contenían niveles orgánicos por debajo de los límites de detección del MOMA, sino también la importancia crítica de las muestras de campo analógicas como Red Stone para validar la próxima generación de instrumentos de vuelo.

Las muestras de Red Stone también se analizaron con SOLID-LDChip, el detector de signos de vida56,57,58, un instrumento TRL5 diseñado para buscar biofirmas moleculares en otros planetas mediante el uso del LDChip (Life Detector Chip), un inmunoensayo sándwich de fluorescencia múltiple. Al igual que en otros análisis de banco de pruebas, las detecciones de SOLID estuvieron ligeramente por encima del límite de detección en las muestras de Red Stone (Fig. S18), pero aún encontraron evidencias de bacterias heterótrofas y, curiosamente, cianobacterias, consistentes con otras firmas biológicas provenientes de microorganismos existentes y relictos utilizando otras técnicas. . La detección por SOLID de restos antiguos de cianobacterias es de particular interés, ya que confirma que el delta del río Piedra Roja tenía suficiente agua para sustentar la fotosíntesis hace millones de años, pero ya no cuando Atacama se volvió más seco con el tiempo (similar al caso de Marte).

En conjunto, Red Stone ofrece una colección única de características geológicas y microbiológicas, proporcionando un sitio modelo analógico excepcional para estudiar la formación y la habitabilidad existente y pasada de un antiguo abanico/delta aluvial que se formó en condiciones áridas en un entorno análogo a Marte59. Los análisis de muestras de Red Stone utilizando bancos de pruebas de rover revelan la relevancia de los experimentos de derivatización de química húmeda para la detección de compuestos orgánicos en espectrómetros de masas, a pesar de que esta técnica no siempre fue capaz de identificar todos los tipos de compuestos orgánicos. Además, el método de inmunoensayo SOLID demostró ser una técnica prometedora para detectar evidencias de vida microbiana, en lugar de solo sus componentes básicos, aunque es posible que los microorganismos marcianos presentes en concentraciones inferiores a las de Red Stone aún no sean detectables. La detección limitada o no detectada por los instrumentos del banco de pruebas del rover de una serie de biofirmas de los microbios únicos existentes y extintos en las muestras de Red Stone también resalta la importancia crítica de una misión de retorno de muestras a Marte, para que las muestras puedan estudiarse a fondo en busca de signos de vida en los laboratorios. en la Tierra60.

El reconocimiento de campo principal y el muestreo del afloramiento de Red Stone se llevaron a cabo en agosto de 2019, aunque el muestreo posterior del sitio también se llevó a cabo en febrero, mayo, agosto y octubre de 2021. Después de inspeccionar los alrededores, se seleccionó la exposición más continua para aprovechar la mejor sección transversal del registro estratigráfico. Tomamos fotografías de referencia y de primer plano antes y después de recolectar material, suficientes para tomar muestras que no se vean afectadas por la meteorización y la cantidad necesaria para el análisis geoquímico. El muestreo se registró metódicamente, incluidas las observaciones de campo y su profundidad, con una cinta métrica lo más perpendicular posible al plano del lecho, y se almacenó en bolsas zip y tubos de vidrio con tapas de papel de aluminio para análisis de biofirmas con el etiquetado adecuado. Algunas formaciones frágiles (revestimientos y capas de sal) se almacenaron adicionalmente en tubos Falcon para poder observarlas y analizarlas adecuadamente más adelante en el laboratorio. Tomamos 17 muestras representativas de los diferentes horizontes a lo largo de la secuencia estratigráfica (algunas requirieron muestreo adicional posterior como se mencionó anteriormente) que se representó en forma de un diagrama de registro gráfico utilizando Strater v5 (Golden Software).

La difracción de rayos X en polvo de muestras a granel se realizó utilizando un Bruker D8 Eco Advance con radiación Cu Kα y un detector lineal Lynxeye XE-T. Las muestras se escanearon entre 5° (2θ) y 60° (2θ) utilizando un tamaño de paso de 0,05° (2θ) y un tiempo de conteo de 1 s. La identificación de fases se realizó comparando el patrón de difracción medido con los patrones de la base de datos PDF con el software DIFFRAC.EVA (Bruker AXS). Posteriormente la fracción arcillosa se obtuvo por decantación según la ley de Stokes. La determinación de la arcilla implicó tratamientos: secado al aire, solvatación con etilenglicol y calentamiento a 350 y 500 °C durante 2 h. Luego, las muestras se escanearon con un tamaño de paso de 0,02° (2θ) en el rango de 2-30°(2θ) con un tiempo de recolección de 1 s en cada paso.

Las muestras orientadas de las muestras de roca fueron analizadas mediante XRD (Ultima IV) conectado con un dispositivo de control de humedad en el Instituto Nacional de Ciencia de Materiales de Japón. Las mediciones se realizaron con radiación monocromática CuKα a 40 kV y 30 mA. Las muestras orientadas se secaron en una estufa de vacío a 100 °C durante 15 h antes de las mediciones. Las muestras secas se colocaron en la cámara de muestras. Los patrones de XRD de las muestras se midieron con una humedad relativa del 1% al 60%.

Para examinar gráficamente las tendencias de la meteorización, incluimos algunos de los diagramas ternarios más utilizados que permiten la interpretación gráfica de los cambios químicos proporcionales. Los diagramas ternarios A-CN-K, ACN y A-CNK-FM, trazados con Grapher v13 (Golden Software).

La temperatura y la humedad relativa se midieron en el campo utilizando microrregistradores duales de temperatura/humedad iButton (Maxim Integrated, San José, CA, EE. UU.) como se hizo anteriormente18,23, y se configuraron para tomar datos cada 15 minutos durante 2 meses.

Las muestras de cálculos rojos se almacenaron a temperatura ambiente y luego se contaron mediante recuentos directos en el laboratorio. Como la visualización celular es menos eficiente cuando los minerales enmascaran las células al adsorber tintes tradicionales, utilizamos SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, EE. UU.) en lugar de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato). Brevemente, se suspendieron 2 g de cada muestra en 10 ml de pirofosfato tetrasódico 0,01 M y se sonicaron suavemente en un limpiador ultrasónico Branson (Danbury, EE. UU.) durante 30 minutos en agua enfriada con hielo. Después de 10 s de sedimentación, se tomaron 2 ml del sobrenadante y se colocaron directamente sobre un filtro de membrana de policarbonato Isopore negro (tamaño de poro de 0,2 μm, Millipore, Massachusetts, EE. UU.). Luego, las membranas se incubaron con 1,5 ml de SYBR Green I (50 μg/L) durante 15 minutos en la oscuridad. Luego se lavaron las membranas con 10 ml de agua destilada y se dejaron secar al aire en la oscuridad. Se depositó una gota de aceite de inmersión sobre un portaobjetos de vidrio, luego el filtro y otra gota de aceite se depositó sobre la superficie del filtro y se cubrió con una tapa de vidrio. Las bacterias se contaron inmediatamente utilizando el microscopio de fluorescencia Zeiss AxioImager M.2 (Carl Zeiss, Jena, Alemania) y un objetivo de inmersión en aceite Zeiss Plan-Apo 63x ⁄ 1,4. Se utilizó un juego de filtros para eGFP (Zeiss Filter Set 38; Excitación ⁄ Emisión: 450–490 ⁄ 500–550 nm) para la visualización de bacterias teñidas con SBI. Las bacterias se contaron seleccionando campos de visión aleatorios, con 20 campos por filtro analizados. Se contaron cinco filtros por muestra, para un total de 10 filtros y 200 campos observados.

Las muestras para la hibridación in situ por fluorescencia por depósito catalizado (CARD-FISH) se fijaron con formaldehído al 4% en PBS y se almacenaron a 4° hasta su posterior análisis. Los microorganismos se separaron de las partículas minerales mediante sonicación y se filtraron en membranas negras de 0,22 mm (Millipore, Alemania) en condiciones asépticas como se describe en la ref. 61. Los experimentos CARD-FISH, la contratinción y sus respectivos controles de autofluorescencia y unión inespecífica se realizaron como se describió anteriormente en detalle62. CARD-FISH se realizaron utilizando sondas mixtas EUB338 I-III63,64 y ARC91565. Además, se realizaron CARD-FISH con NON33866 como control de hibridación adicional. Las muestras se visualizaron y tomaron imágenes como ya se informó61.

Las muestras de Red Stone se almacenaron a temperatura ambiente y se extrajo el ADN de ellas en el laboratorio utilizando el kit DNeasy PowerSoil Pro (Quiagen, Düsseldorf, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se realizó anteriormente18,23,41.

Las concentraciones de ADN fueron cuantificadas por Picogreen. Luego, se utilizó entrada variable de ADN y número variable de ciclos en una primera PCR con ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® Hot Start (New England Biolabs) en presencia de:

Cebadores de 100 nM para amplificación de 16 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACCTACGGGNGGCWGCAG-3' y 5'- TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3', estos cebadores amplifican la región V3-V4 de 16 S), cebadores de 200 nM para amplificación de 18 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCT ACAGCCAGCAVCYGCGGTAAY- 3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCGTCAATTHCTTYAART-3'), cebadores de 200 nM para la amplificación de Archaea (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACCGGRAAACTGGGGATAAT-3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTRTTACCGCGGGCGGCTGBCA-3'), cebadores de 200 nM en el caso de ITS (5'-AC ACTGACGACATGGTTCTACATCCTCCGCTTATTGATATGC- 3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTGAATCATCGAATCTTTGAA-3') y cebadores de 200 nM para cianobacterias (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACAGGGGAATYTTCCGCAATGGG-3' como directo, y 5'-TACGGTAGCAAGACTTGGTCTGACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3' o 5'-TACGGTAGCAG AGACTTGGTCTGACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3' al revés). Tras la primera PCR, se realizó una segunda PCR de 12 ó 14 ciclos con ADN Polimerasa de Alta Fidelidad Q5® Hot Start (New England Biolabs) en presencia de 400 nM de cebadores (5'-AATGATACGCGACCACCGAGATCTACACTGACGACATGGTTTCTACA-3' y 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[código de barras de 10 nucleótidos]-TACGGTAGCAAGACTTGGTCT-3') de la biblioteca de códigos de barras Access Array para secuenciadores Illumina (Fluidigm).

Los amplicones finalmente obtenidos se validaron y cuantificaron mediante Bioanalyzer y un pool equimolecular se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se tituló mediante PCR cuantitativa utilizando el “kit Kapa-SYBR FAST qPCR forLightCycler480” y un estándar de referencia para la cuantificación. El conjunto de amplicones se desnaturalizó antes de sembrarlos en una celda de flujo a una densidad de 10 pM, donde se formaron y secuenciaron grupos utilizando un “MiSeq Reagent Kit v3”, en una secuenciación de 2 × 300 pares en un secuenciador MiSeq. Observamos aquí que no se encontraron secuencias de arqueas o eucariotas (excepto algunos contaminantes fúngicos bien conocidos), por lo que solo se presentan datos de 16 S en el informe principal. Todos los datos de secuencia sin procesar se depositaron en el NCBI Sequence Read Archive (SRA, //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con el número de acceso PRJNA908755.

Las secuencias sin procesar se procesaron en el software MOTHUR v.1.43.067, utilizando un script personalizado basado en MiSeq SOP68, como se empleó anteriormente69,70,71,72,73. La riqueza microbiana de OTU (S) y el índice de diversidad de Shannon (H') se calcularon con lenguaje R para computación estadística (R Core Team, 2019), utilizando el paquete “vegano” v.2.5-674. Para una mejor visualización de la composición de la comunidad bacteriana, se construyó un mapa de calor mediante el software STAMP v.2.1.375.

En el laboratorio, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y luego se inocularon asépticamente en placas de Petri que contenían agar y caldo Luria-Bertani (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.), medio marino o medio de crecimiento Czapek Dox modificado (CondaLab, Torrejón de Ardoz, España). Esto se hizo rociando directamente un total de 100 mg por muestra de suelo en las placas de Petri que contenían los medios antes mencionados, incubando estas placas a 25 °C. En la mayoría de los casos, las colonias que surgieron de las partículas del suelo fueron evidentes 2 semanas después de la inoculación. Luego, todas las colonias se volvieron a cultivar en el medio en el que se aislaron por primera vez, para obtener suficiente biomasa para la posterior extracción y almacenamiento de ADN.

Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y se extrajo el ADN de ellas en el laboratorio utilizando el kit microbiano DNeasy UltraClean (Quiagen, Düsseldorf, Alemania) según las instrucciones del fabricante y como se realizó anteriormente18,21,41.

Como se realizó previamente18,21,41, se amplificaron 16 genes S rRNA de aislados bacterianos en el laboratorio utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y los cebadores 341 f (5′CCT ACG GGGNGGC WGC AG3′) y 785r (5′GAC TAC HVGGG TAT CTA ATC C′). Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 95 °C durante 5 min y 25 ciclos de (95 °C durante 40 s, 55 C durante 2 min, 72 °C durante 1 min) seguidos de 72 °C durante 7 min. El ARNr 18 S de aislados de hongos se amplificó en el laboratorio utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y los cebadores F566 (5'CAG CAG CCG CGG TAA TTCC3') y R1200 (5'CCC GTG TTG AGT CAA ATT AAG C3'). Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 95 °C durante 15 min y 35 ciclos de (95 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s, 72 °C durante 1 min) seguidos de 72 °C durante 10 min. Las reacciones resultantes se visualizaron en un gel de agarosa TAE al 2% a 50 V. La secuenciación automatizada de los productos de PCR resultantes fue realizada por Macrogen DNA Sequencing Inc. (Seúl, Corea). Se verificó la calidad de las secuencias utilizando el software BioEdit (Ibis Therapeutics, Carlsbad, EE. UU.) y se recortaron los extremos antes de usar la opción Megablast para secuencias muy similares del algoritmo BLASTN contra la base de datos no redundante del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm. nih.gov) para buscar las especies más cercanas a cada uno de los aislados obtenidos.

El análisis filogenético de las secuencias de genes aislados de 16 S rRNA y 18 S rRNA se realizó alineando secuencias mediante comparación de secuencias múltiples mediante expectativa logarítmica, analizadas con jModelTest y luego con Phylip NJ (bootstrap 10,000), todas las herramientas del software de análisis filogenético Bosque disponible gratuitamente. (versión 1.7.152)134. Todas las secuencias de genes aislados se han depositado en la base de datos de secuencias genéticas de los NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tanto para las secuencias de 16 S rRNA (OP955639 a OP955657) como para 18 S rRNA (OP954719 y OP962462). ).

A submuestras liofilizadas de suelos (10 a 20 g) se les agregaron estándares internos de n-alcanos (tetracosano-D50) y ácidos n-alcanoicos (ácido mirístico-D27) y luego se extrajeron con una mezcla de diclorometano y metanol (DCM:/ MeOH, 3:1, v/v) mediante sonicación ultrasónica (3 ciclos de 10 min). El extracto lipídico total (TLE) se concentró a ~0,5 ml mediante evaporación rotatoria y luego se digirió durante la noche a temperatura ambiente en una mezcla de potasio metanólico (6% p/p), y se separó adicionalmente en fracciones neutras y ácidas. La fracción lipídica neutra se obtuvo extrayendo la mezcla metanólica de potasio con 30 ml de n-hexano (Hx) tres veces, rotavaporándola y recuperándola con ~1 ml de Hx:DCM (9:1, v/v). La fracción lipídica ácida se obtuvo agregando HCl a la mezcla metanólica de potasio restante y extrayéndola con 30 ml de Hx (tres veces), luego se concentró mediante evaporación rotatoria y se recogió con DCM. La separación adicional de la fracción neutra en subfracciones no polares (hidrocarburos) y polares se realizó eluyendo la fracción neutra concentrada (~1 ml de Hx:DCM) en una columna de alúmina usando ~0,5 g de polvo de Al2O3 en un Pasteur precombustible. Pipetear con 4,5 ml de Hx:DCM (9:1, v/v) y 3 ml de DCM:metanol (1:1, v/v), respectivamente. Tanto las fracciones ácidas como las no polares se analizaron mediante espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), mediante inyección directa en Hx, el primero, o mediante inyección después de la derivatización con BF3 en MeOH para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). El análisis GC-MS se realizó utilizando un sistema GC 6850 acoplado a un MSD VL 5975 con un detector de triple eje (Agilent Technologies) que opera con ionización electrónica a 70 eV y escaneando desde m/z 50 a 650. Se inyectaron 1 µl de analitos y se separaron en una columna HP-5MS (30 mx 0,25 mm id x 0,25 µm de espesor de película) con He como gas portador a un flujo constante de 1,1 ml·m-1. Para analizar la fracción no polar, la temperatura del horno se programó para aumentar gradualmente de 50 °C a 130 °C a 20 °C·min-1 y luego a 300 °C a 6 °C·min-1 (mantenida 20 min). ). Para analizar la fracción ácida, la temperatura del horno se programó de 70 °C a 130 °C a 20 °C·min-1 y luego a 300 °C a 10 °C·min-1 (mantenida 10 min). La temperatura del inyector se fijó en 290 °C, la línea de transferencia en 300 °C y la fuente de MS en 240 °C. La identificación de compuestos se basó en la comparación de espectros de masas con materiales de referencia y su cuantificación mediante el uso de curvas de calibración externas de n-alcanos (C10 a C40) y ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME; C8 a C24). Todos los productos químicos y estándares fueron suministrados por Sigma Aldrich (San Luis, Missouri, EE. UU.). La recuperación de los estándares internos promedió 71 ± 14%.

La composición de isótopos estables del carbono orgánico (δ13C) se midió en muestras de suelo a granel mediante espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS), siguiendo el método del USGS76. Brevemente, todas las muestras se homogeneizaron moliéndolas con un mortero. Luego se descarbonataron (suelos) con HCl (3 N) y, después de 24 h de equilibración, se ajustaron a pH neutro con agua ultrapura. Las muestras se secaron en estufa (50 °C) hasta peso constante. Las proporciones de δ13C y δ15N se midieron en un IRMS MAT 253 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y se informaron en la notación estándar por mil (‰). Se utilizaron tres estándares certificados (USGS41, OIEA-600 y USGS40) con una precisión analítica de 0,1 ‰. El contenido de carbono orgánico total (% de TOC) se midió con un analizador elemental (HT Flash, Thermo Fisher Scientific, Waltham Massachusetts, EE. UU.) durante la medición de los isótopos estables.

Los espectros Raman se realizaron excitando la muestra con un láser de estado sólido Nd:YAG no polarizado de longitud de onda de 532 nm. Después de enfocar en un monocromador (Horiba Jobin Yvon HRi550), con una rejilla de difracción de 1200 ranuras/mm, la luz dispersada se detectó con un dispositivo de carga acoplada (CCD), 1024×256 píxeles, enfriado a 203 K para reducción de ruido térmico. . El espectrómetro está conectado mediante fibra óptica a un microscopio B&W Tek con objetivo de 50x que permite un tamaño de punto sobre la muestra de 42 µm (Microbeam SA, España). La resolución espectral, con un ancho de rendija de 200 µm, resulta mejor que 5 cm-1. Los espectros Raman se tomaron en un rango de potencia del láser de 20 a 150 mW, 10 a 100 s de tiempos de integración y 3 acumulaciones.

La caracterización infrarroja de muestras de Piedra Roja se realizó en el INAF-Observatorio Astrofísico de Arcetri (Florencia, Italia) utilizando un interferómetro de doble péndulo de haz único VERTEX 70 v (Bruker), equipado con un accesorio de reflexión difusa Praying MantisTM (Harrick DRIFT) para transportar Realiza análisis de espectroscopia de transformada de Fourier infrarroja de reflectancia difusa (DRIFTS). Específicamente, adquirimos espectros de reflectancia en la región espectral de 400-8000 cm-1, utilizando una resolución de 4 cm-1, una fuente Globar, un divisor de haz KBr, un detector DTGS, y en la región espectral de 8000-20000 cm-1. utilizando una resolución de 8 cm−1, una fuente de tungsteno, un divisor de haz de CaF2 y un detector de InGaAs, para cubrir todo el rango espectral relevante para instrumentos de vuelo espacial como SuperCam (rango espectral 1,3-2,6 μm + 0,4–0,85 μm) a bordo de la misión rover Mars 2020 de la NASA, Ma_MISS (rango espectral 0,5-2,3 μm), ISEM (rango espectral 1,1-3,3 μm) y MicrOmega (rango espectral 0,95-3,65 μm + 0,5-0,9 μm) a bordo del rover ESA-Roscosmos ExoMars 2022 misión.

Las muestras de Piedra Roja se trituraron en un mortero de ágata y se tamizaron usando un juego de tamices de diferente tamaño de poro, para obtener tamaños de partículas iguales o menores a 250 μ FT. El Raman se realizó usando un instrumento Bruker RFS 100 con una fuente de excitación de 1064. nm y una mancha de 100 micras. Se adquirieron dos espectros de dos puntos diferentes utilizando un total de 1024 exploraciones por espectro. Análisis Micro Raman a 633 nm. Para ello se utilizó una fuente de excitación de 633 nm y un microscopio NIKON como óptica de enfoque/recogida, dando tamaños de punto de análisis variables, dependiendo del objetivo, hasta puntos de 25 micras. La espectroscopia de alto rendimiento se realizó con un Holospec 1.8i y un cabezal Raman de Kaiser Optical Systems. Para los análisis guiados por el operador, se analizaron cuatro espectros diferentes para los componentes principales, centrándose en los granos individuales. Para el simulador RLS, se adquirió la adquisición automática de un total de cien puntos de 50 micras, con un sistema automatizado descrito en la ref. 77.

Se realizaron cinco observaciones de 30 disparos láser cada una en las muestras con la réplica de laboratorio del instrumento ChemCam. Las muestras se situaron a 1,6 metros del instrumento, contenidas en una cámara rodeada por 7 Torr de CO2 para imitar la atmósfera de Marte. Los datos LIBS se procesaron previamente utilizando los métodos descritos en 78 para eliminar el fondo y el continuo no láser, y para calibrar la longitud de onda. Las observaciones TRLS (espectroscopia de luminiscencia resuelta en el tiempo) se realizaron con una réplica de laboratorio del instrumento SuperCam.

El experimento de pirólisis similar a un vuelo se realizó utilizando un pirolizador multidisparo Frontier Laboratories 3030D de la compañía Quantum Analytics. Las muestras se pulverizaron y se depositaron alícuotas (~20 mg) en la copa de pirólisis de acero inoxidable. Las muestras se calentaron de 40 a 850 °C a 35 °C/min, lo que reprodujo la velocidad de la rampa de pirólisis utilizada en el instrumento de Análisis de Muestras en Marte (SAM) a bordo del rover Curiosity79. Los experimentos de espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS) se realizaron en un GC traza 1310 acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolo ISQ (ambos de la empresa Thermo Fisher). El GC estaba equipado con una columna capilar Restek MXT-5 (30 m de largo x 0,25 mm de diámetro interior unida con una fase estacionaria de 0,25 µm de espesor) similar a la utilizada por el SAM y que permitía analizar y separar una amplia gama de moléculas (~C5 -C30). La rampa de GC se calentó inicialmente a 35 °C y se mantuvo durante 5 min, seguida de una rampa de 5 °C/min hasta 300 °C, mantenida durante 2 min. El gas portador fue helio y se ajustó a 1,2 ml/min. Las muestras se analizaron en modo splitless y las temperaturas del inyector, la línea de transferencia y la fuente de iones se establecieron en 300 °C. El MS se configuró para escanear rangos de masas entre m/z 40 y 535 uma. Durante la pirólisis, los volátiles quedaron atrapados en la entrada de la columna mediante una trampa fría de vidrio con nitrógeno líquido ubicada dentro del horno del GC, justo después del inyector del GC. Cuando terminó la pirólisis, la trampa fría se detuvo y se calentó, por lo que puede comenzar el análisis por GC. Se realizaron blancos entre cada análisis simple para prevenir y controlar posibles contaminaciones. MTBSTFA-DMF es uno de los dos reactivos de química húmeda presentes en el instrumento SAM54. La derivatización de MTBSTFA es una técnica de sililación no selectiva que facilita la extracción y detección de moléculas polares (p. ej., aminoácidos, ácidos grasos) que no pueden analizarse directamente mediante pirólisis-GCMS y se demostró que funciona en Marte para detectar moléculas polares80. Los experimentos de derivatización de SAM se imitaron en el laboratorio depositando aproximadamente 20 mg de muestra sólida en la copa de pirólisis, que a su vez se colocó en un vial abierto de 2 ml. Las muestras se enriqueceron con 40 nmol de DL-fluorovalina utilizada como estándar interno para controlar la eficiencia de la derivatización después del análisis. Luego, las muestras se secaron durante aproximadamente 48 h a 40 °C para limitar la interferencia del reactivo MTBSTFA con el agua adsorbida en la muestra. Antes del análisis de pirólisis, se depositaron 20 uL de MTBSTFA-DMF en el vaso de muestra y se calentaron a 75 °C durante 15 minutos después de sellar el vial. Además, para imitar el primer paso de calentamiento SAM, esta temperatura se ha optimizado previamente y se ha demostrado que es la más eficiente para derivatizar moléculas polares estándar. Después de calentar, la copa se cargó rápidamente en el pirolizador para minimizar la evaporación del disolvente MTBSTFA. Luego, la muestra se calentó desde 75 °C hasta 850 °C en condiciones similares a las de SAM utilizando la velocidad de calentamiento SAM de 35 °C/min. La columna cromatográfica se calentó inicialmente a 40 °C (sin retención) seguido de una primera rampa de 10 °C/min hasta una temperatura de 80 °C, seguida de una segunda rampa de temperatura a 5 °C/min hasta una temperatura final. de 310 °C mantenido durante 5 min para hornear la columna antes del siguiente análisis. En cuanto al experimento de pirólisis, el gas portador utilizado fue helio y se ajustó a un caudal de 1,2 ml.min-1 con un flujo dividido de 75 ml/min para limitar la saturación de los reactivos. La fuente de iones MS y la línea de transferencia se configuraron a 300 °C y los iones producidos por la fuente de ionización de electrones de 70 eV se escanearon con relaciones masa-carga (m/z) comprendidas entre 40 y 535 con un tiempo de escaneo de 0,2 s. desde 9 min (retraso del disolvente) hasta el final de la ejecución.

Pirólisis: Todos los procedimientos instrumentales se realizaron utilizando un pirolizador multidisparo 3030D de Frontier Laboratories (FrontierLab) montado en el inyector dividido/sin división de un cromatógrafo de gases Trace Ultra acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolo ISQ (Thermo Fisher).

Se pesaron 20 mg de cada muestra en una copa de acero limpiada orgánicamente (precisión de microescala: 0,01 mg) y se colocaron en la parte superior del pirolizador (frío). Luego, la copa se introdujo en el horno del pirolizador calentado a 400 °C o 600 °C y permaneció durante 30 s a esta temperatura. El contenido gaseoso de la muestra se transfirió directamente a una columna MXT-5 similar a MOMA (20 m de largo; 0,25 mm de diámetro interno; 0,25 μm de espesor de fase estacionaria) (Restek) para la separación cromatográfica. El inyector se configuró a 250 °C y el programa de temperatura del GC comenzó a 40 °C seguido de una rampa de 10 °C. min-1 para alcanzar una temperatura final de 300 °C y permaneció durante 10 min a 300 °C. En cuanto al espectrómetro de masas, la fuente de iones y la temperatura de la línea de transferencia se calentaron a 300 °C, y el haz de electrones de la fuente de iones se ajustó a 70 eV para escanear la relación masa de iones a carga (m/z) de 10 a 600.

Derivatización: Todas las muestras se derivatizaron con un reactivo sililante presente en el conjunto instrumental del MOMA, N, N-metil-terc-butil-dimetilsililtrifluoroacetamida (MTBSTFA). Se añadió N,N-dimetilformamida (DMF) a MTBSTFA (1:4) como disolvente y para ayudar a promover la reacción de derivatización81. Se realizaron dos métodos de derivatización: un método de derivatización directa y extracción previa a la derivatización.

Derivación directa; Se transfirieron 50 mg de cada muestra a un vial de vidrio (precisión de microescala: 0,01 mg). Se agregaron 100 μL de reactivo de derivatización y 1 μL de estándar interno (laurato de metilo a 10-2 M en acetato de etilo). Luego la solución se calentó a 75 °C durante 15 min. Se inyectaron manualmente 0,5 μL del sobrenadante en el instrumento GCMS.

Método de extracción; Debido a que con el experimento de pirólisis se encontró que la materia orgánica presente en las muestras estaba ausente o en muy baja abundancia, se procedió a una extracción antes de la derivatización para concentrar el contenido orgánico. Se transfirieron 50 mg de la muestra a un vial de vidrio (precisión de microescala: 0,01 mg). Se agregaron a la muestra 250 μl de una solución (1:1) de agua y metanol para extraer compuestos solubles en agua, como aminoácidos, así como otros compuestos orgánicos que tienen una mayor solubilidad en disolventes orgánicos, como los ácidos grasos. Los tapones de rosca se sellaron adicionalmente con parafilm para evitar fugas de agua y los viales se colocaron en un baño de ultrasonidos (Branson 2200) durante 2 h. Luego se transfirió la solución líquida a un tubo Eppendorf y se centrifugó para separar las fases. El tubo se calentó a 75 °C bajo un flujo de nitrógeno hasta que la fase líquida se evaporó. Se agregaron 50 μL de agente de derivatización y 1 μL de estándar interno (igual que anteriormente). La muestra se calentó a 75 °C durante 15 minutos y se inyectaron manualmente 0,5 μl del sobrenadante con una microjeringa en el GC. La posible presencia de contaminantes químicos de los tubos Eppendorf mediante calentamiento se evaluó mediante GC-MS de control y no se detectó contaminación. Se realizaron dos réplicas para cada muestra para ambos métodos para asegurar la repetibilidad de nuestros experimentos. Todos los procedimientos instrumentales se realizaron en un cromatógrafo de gases Trace 1300 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ 9000. Utilizamos una columna RTX-5 estándar (30 m de largo; 0,25 mm de diámetro interno; 0,25 μm de espesor de fase estacionaria) de Restek. El programa de temperatura y los parámetros del espectrómetro de masas fueron los mismos que para los experimentos de pirólisis.

Un inmunosensor basado en microarrays de 200 anticuerpos (LDChip o Life Detector Chip), el núcleo del instrumento SOLID (Signs of Life Detector) desarrollado para la exploración planetaria, apunta a una amplia variedad y tamaños moleculares de biomarcadores microbianos, en su mayoría polímeros82,83,84 . La fracción IgG de anticuerpos policlonales se imprimió en un microarray de patrón de puntos por triplicado en portaobjetos de vidrio para microscopio, de modo que se puedan configurar 9 LDCip completos por portaobjetos como se describió anteriormente85. La lista completa de anticuerpos en LDChip se puede encontrar en la ref. 86. Las muestras sólidas molidas se procesaron siguiendo un procedimiento similar al automático perfumado por el instrumento SOLID. Brevemente, se resuspendieron 0,5 g en 2 ml de solución salina tamponada con tris de lisis/incubación con tampón Twin20 doblemente reforzado (TBSTRR) (0,4 MTris-ClH, pH 8, NaCl 0,3 M, Tween 20 al 0,1%), se sometieron a ultrasonidos durante 3 × 1 min. pulsos y filtrado a través de 20 micrones para eliminar partículas gruesas86. Luego, se incubaron 50 uL de cada extracto crudo durante 8 h a 4 °C con LDCip en cada cámara correspondiente del Módulo de análisis MultiArray (MAAM)71 que simula la Unidad de análisis de muestras (SPU) SOLID. El control en blanco solo contenía buffer. Después de lavar con tampón TBSTRR, todas las cámaras se incubaron con 50 uL de una mezcla de anticuerpos marcados con fluorescencia (0,5-1 ug/mL cada uno) durante 12 h a 4 °C como trazadores de las inmunorreacciones. Después de lavarlos y secarlos, los chips se escanearon en busca de fluorescencia, la imagen se procesó, cuantificó y analizó como se describe en otra parte85,86.

Disponibilidad de datos y materiales: todos los datos y muestras están disponibles gratuitamente previa solicitud a AAB. Todos los datos de secuencia sin procesar de NGS se depositaron en el NCBI Sequence Read Archive (SRA, //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con el número de acceso PRJNA908755. Todas las secuencias de genes aislados se han depositado en la base de datos de secuencias genéticas de los NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tanto para las secuencias de 16 S rRNA (OP955639 a OP955657) como para 18 S rRNA (OP954719 y OP962462). ). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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La investigación que condujo a estos resultados es una contribución del Proyecto "MarsFirstWater", financiado por el Consejo Europeo de Investigación, Consolidator Grant no 818602 a AGF, y por la subvención del Programa Científico Human Frontiers n° RGY0066/2018 a AA-B. Los fondos adicionales proporcionados fueron proporcionados por la subvención MINECO PID2019-107442RB-C32 (OP-B. y AM), Subvenciones para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, números de subvención 17H06458 y 21H04515 (KF), números de subvención 17H06456 , 17H06458, 20H00195 y 21H04515 (KF e YS), Consejería de Educación e Investigación, Comunidad Autónoma de Madrid/Programa del Fondo Social Europeo (MAFM), subvención n° ESP2017-87690-C3-3-R (DC), Ramón y Subvención Cajal n° RYC2018-023943-I (LS-G.), subvención AEI MDM-2017-0737 y subvención MCIN/AEI PID2019-107442RB-C32 (VM-I.), MCIU/AEI (España) y FEDER (UE ) subvención n° PGC2018-094076-B-I00 (JW y CA), acuerdo de la Agencia Espacial Italiana 2017-48-H.0 (TF, JRB y GP), subvención del Ministerio de Ciencia de España PID2019-107442RB-C31 (JAM , MV, GLR, AA y FR), programa de becas de excelencia de María Zambrano (CA3/RSUE/2021-00405), financiado por el Ministerio de Universidades (MFM), contratos del Programa de Exploración de Marte de la NASA NNH13ZDA018O, NNH15AZ24I, NNH13ZDA018O y Laboratorio LANL Financiamiento para Investigación y Desarrollo Dirigido (LDRD) XX5V (AMO, RCW, AR y SMC), subvención NASA-GSFC NNX17AJ68G (MM y SSJ), NES enfocado en el Análisis de Muestras en Marte de la misión Mars Science Laboratory y el Analizador de Moléculas Orgánicas de Marte de la misión Exomars 2022 (OM, CS y CF), y las subvenciones RTI2018-094368-B-I00 y MDM-2017-0737 Unidad de Excelencia “Maria de Maeztu”- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) del Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por “FEDER Una manera de hacer Europa” (CE, MGV, MM-P. y VP). RCW agradece a Dot Delapp por realizar el preprocesamiento de los datos LIBS. Los autores también agradecen al explorador terrestre del USGS por proporcionar los datos satelitales de Sentinel 2020.

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Armando Azua-Bustos, Alberto G. Fairén, Olga Prieto-Ballesteros, Daniel Carrizo, Laura Sánchez-García, Victor Parro, Cristina Escudero, Victoria Muñoz-Iglesias, Maite Fernández-Sampedro, Antonio Molina, Miriam García Villadangos & Mercedes Moreno-Paz

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Armando Azua-Bustos

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Alberto G. Fairén

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LATMOS/IPSL, UVSQ Universidad Paris-Saclay, Universidad de la Sorbona, CNRS, 11 Bd d’Alembert, 78280, Guyancourt, Francia

Maëva Millan

Programa de Ciencia, Tecnología y Asuntos Internacionales, Universidad de Georgetown, Washington, DC, 20057, EE. UU.

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Yasuhito Sekine y Keisuke Fukushi

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Elizabeth Rampe

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Correspondencia a Armando Azua Bustos.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Hamidah Idris, Carol Stoker y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Azua-Bustos, A., Fairén, AG, González-Silva, C. et al. El microbioma oscuro y la materia orgánica extremadamente baja en el delta fósil de Atacama revelan los límites de detección de vida en Marte. Nat Comuna 14, 808 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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Recibido: 28 de junio de 2022

Aceptado: 17 de enero de 2023

Publicado: 21 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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